Иммунная реактивность организма на фоне гипофизарно-надпочечниковых изменений при острой кровопотере (экспериментальное исследование) 14. 00. 36 аллергология и иммунология

УДК 612.017.1: 616.433/.453:616 – 005.1 – 036.11 – 092.4 На правах рукописи

14.00.36 – аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Республика Казахстан

Астана, 2010
Работа выполнена в ао «медицинский университет астана»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Зуева О.М.

Научный консультант: кандидат медицинских наук

Хамчиев К.М.

Официальные оппоненты: д.м.н., профессор Калимолдаева С.Б.

д.м.н., профессор Сатыбалдиева Ж. А.

Ведущая организация: Институт кардиологии

Защита состоится «_10_» декабря 2010 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д ____ при Национальном медицинском университете им. С.Д. Асфендиярова Министерства здравоохранения Республики Казахстан по адресу: ______________________.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Национального медицинского университета С.Д. Асфендиярова по адресу: __________________________________.

Автореферат разослан “_09_”__ноября__ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор _____________

Любое экстремальное и тем более – терминальное состояние, перенесенное организмом, является для него стрессом [1].

При стресс-реакции наряду с изменениями в основных интегрирующих системах организма (нервной, кровеносной, эндокринной), отмечаются также закономерные реакции иммунной системы. Однако взаимосвязь между гипофизарно-адренокортикальной системой и иммунитетом при стрессе является не только одним из наиболее изученных, но и наиболее противоречивых вопросов в теории стресса [2,3]. Так, с одной стороны, повышение содержания глюкокортикоидов подавляет функции лимфоидных и макрофагальных клеток, угнетают проявления клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а с другой, в организме существуют кортикостероид-резистентные клоны клеток, которые сохраняют и даже активизируют реакции даже при введении сверхмаксимальных доз глюкокортикоидов [4,5].

Введение в организм адренокортикотропного гормона вызывает угнетение гуморального иммунного ответа [6]. Свой вклад в нарушения регуляции иммунологических реакций вносят изменения содержания в организме катехоламинов и минералокортикоидов [7-9].

Наличие угнетения иммунных механизмов при различных вариантах стресса может иметь клиническое значение. Терминальные состояния, связанные с острой травмой обычно требуют длительного восстановительного лечения. Подавление иммунных механизмов, как обусловленное нарушениями гормонального статуса и регуляторных систем самого организма, так и применением медикаментозных препаратов, неблагоприятно воздействует на заживление травматических повреждений, способствует развитию осложнений [10].

Выявлено, что степень депрессии различных звеньев иммунной системы в шоковом периоде травматической болезни зависит от тяжести травмы и величины кровопотери [11]. В ряде исследований указано на ведущую роль нарушений клеточного иммунитета в их структуре.

Однако до последнего времени остается малоизученными особенности реагирования иммунного системы на стресс и взаимосвязи отдельных иммунологических механизмов с нарушениями гипофизарно-надпочечниковой системы после острой кровопотери.

Цель исследования

Оценка роли гипофизарно-надпочечниковой системы в регуляции иммунной реактивности после терминального состояния.

1. Изучить динамику содержания АКТГ, кортизола и катехоламинов у крыс, перенесших терминальное состояние в результате острой кровопотери.

2. Исследовать состояние клеточных, гуморальных, фагоцитарных механизмов иммунной системы и цитокиновой регуляции после перенесенного терминального состояния.

3. Выявить взаимосвязи реакции гипофизарно-надпочечниковой и иммунной системы после перенесенного терминального состояния.

Впервые комплексно изучены показатели иммунной и гипофизарно-надпочечниковой систем в раннем периоде после моделирования терминального состояния путем острой кровопотери.

Показано, что иммунная система в ранние сроки после перенесенного терминального состояния характеризуется снижением числа лимфоцитов в периферической крови, центральных и периферических органах иммуногенеза (тимусе и селезенке). Впервые выявлены особенности соотношений лимфоцитов различных кластеров дифференцировки в динамике после перенесенного терминального состояния.

В раннем периоде после терминального состояния наблюдается дисбаланс фагоцитарного звена иммунной системы, заключающийся в активации кислородозависимых метаболических процессов в сочетании со снижением фагоцитарной активности и содержания в клетках лизосомальных катионных белков. Впервые также выявлено резкое повышение содержания циркулирующих иммунных комплексов и замедление его восстановления после перенесенного терминального состояния.

Впервые определена динамика содержания некоторых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, выявлено резкое преобладание провоспалительных механизмов в ранние сроки после моделирования терминального состояния.

Доказано что, степень выраженности изменений иммунной и гипофизарно-надпочечниковой систем является фактором, определяющим тяжесть изменений иммунной системы в постгеморрагическом периоде.

Наличие взаимосвязей нарушений функции гипофизарно-надпочечниковой и иммунной системы в генезе терминального состояния определяют возможность воздействия на иммунные механизмы посредством нормализации гормонального статуса.

Установлено, что в первые сутки после острой кровопотери прогностическое значение имеет определение концентрации в крови кортизола и АКТГ.

Прогностическая значимость содержания лимфоцитов некоторых кластеров дифференцировки, показателей фагоцитарной системы, содержания ЦИК, концентрации регуляторных цитокинов и их динамики при терминальных состояниях позволяет рекомендовать разработку клинической системы их определения при обследовании пациентов, перенесших клиническую смерть с целью определения риска летального исхода.

1. Период после моделирования терминального состояния характеризуется развитием изменений функционирования иммунной системы, проявляющейся лимфопенией, изменением соотношений содержания в крови лимфоцитов различных кластеров дифференцировки, активацией кислород-зависимых метаболических реакций и угнетением фагоцитарной активности клеток.

2. Изменения со стороны системы иммунитета имеют достоверные взаимосвязи с нарушениями функционирования гипофизарно-надпочечниковой системы: отмечается фазность динамики АКТГ и кортизола в крови, повышение содержания катехоламинов в эритроцитах, имеющие достоверные функциональные и корреляционные связи с развитием иммунодефицитного состояния.

Внедрение результатов исследования:

Основные результаты диссертации используются в учебном процессе ...

Диссертация изложена на 93 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 4 разделов собственного исследования, заключения, включающего выводы и рекомендации для практического внедрения, библиографического списка использованных источников, включающего 175 наименований, содержит 13 таблиц, 21 рисунок.

Эксперименты проведены на 115 белых беспородных крысах обоего пола массой от 140 до 230 г. Животные содержались на стандартном рационе вивария и брались в эксперимент натощак.

Экспериментальные животные распределялись по следующим группам:

1 группа - интактные животные – (15 крыс). Кроме наркоза, взятия крови, костного мозга и лимфоидных органов, эти животные не подвергались экспериментальным воздействиям.

2 группа - экспериментальная – 100 белых крыс.

Эвтаназию всех исследуемых животных осуществляли в одно и тоже время (9-10 часов утра) для предотвращения суточных колебаний исследуемых показателей. Исследовали тимус, селезенку, костный мозг, цельную кровь, плазму и сыворотку крови.

У фиксированной крысы на спине под эфирным наркозом выделяли наружную подвздошную артерию, так как она имеет хорошо развитую сеть коллатералей с сосудами соседних областей. После этого лигировали дистальный конец и через небольшой надрез (1 мм) сосуд канюлировали затупленной иглой диаметром 0,8 мм. Для предупреждения свертывания крови внутриартериально вводили гепарин в дозе 500 ЕД/кг, через 1 мин осуществляли кровопускание.

Кровь брали из наружной подвздошной артерии животного. Откалиброванный сосуд для взятия крови был соединен с канюлей хлорвиниловой трубки и находился ниже уровня операционного столика на 10 см. Объем кровопотери составлял 9,230,16 мл, что составляло 40% от общего объема крови.

После терминального вдоха животное интубировалось и через 5 минут клинической смерти осуществляли реанимационные мероприятия по методу Неговского В.А.

Летальность экспериментальных животных после моделирования острой кровопотери составила в срок до 1 часа - 2,0% от исходной численности группы; до 3 часов – 1,2%; до 6 часов – 1,5%; до 24 часов – 2,0%, до 3 суток – 5,9% и до 7 суток – 15,8%.

Методы исследования:

Гемограмма

Выделение иммуннокомпетентных клеток из крови и лимфоидных органов

Определение числа лимфоцитов и количества клеток различных кластеров дифференцировки методом моноклональных антител

Определение цитокинов методом иммуноферментного анализа

Расчет лимфоидных индексов (тимический индекс, селезеночный индекс).

Определение лизосомальных катионных белков

Исследование функционально-метаболической и фагоцитарной активности гранулоцитов

Определение циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови

Определение гормонов гипофизарно-надопочечниковой системы (адренокортикотропного гормона – АКТГ в плазме, кортизола в сыворотке крови).

Определение уровня катехоламинов в плазме и эритроцитах

Статистическая обработка полученных результатов
Результаты исследования и их обсуждение

Состояние гипофизарно-надпочечниковой системы в постгеморрагическом периоде

Выяснение закономерностей восстановления жизненно важных функций организма после острой кровопотери невозможно без изучения роли нейро-эндокринной системы в формировании защитно-компенсаторных и патологических процессов оживленного организма.

Как видно из данных, представленных на рисунке 1, к 1-му часу восстановительного периода после 5-минутной острой кровопотери концентрация АКТГ увеличивалась на 30,3% (p<0,05) относительно исходных данных.

Через 3 часа после эксперимента содержание данного гормона продолжало нарастать, и превышение над исходным уровнем составило 143,4% (p<0,001). По сравнению с показателями 1-го часа, полученные результаты были выше на 86,9% (p<0,05).

К 6-му часу после острой кровопотери содержание АКТГ в сыворотке крови экспериментальных животных увеличилось еще на 18,4% (21,9±1,6 пМ/л, p>0,05) по отношению к показателям 3-го часа и было выше на 188,4% (p<0,01) исходного уровня (максимальное среднее значение показателя).

Через 24 часа после моделирования терминального состояния уровень АКТГ составлял 16,4±1,1 пМ/л, что было выше на 115,8% (p<0,01) величин, зарегистрированных у интактных животных. В то же время, по сравнению с предыдущим исследованием было зарегистрировано снижение показателя на 25,1% (p<0,05).

Дальнейшее снижение содержания АКТГ отмечалось к 3-м суткам после острой кровопотери, когда уровень гормона в плазме крови составлял 11,5±0,7 пМ/л. Содержание АКТГ к 3-му дню эксперимента было ниже данных, зарегистрированных через 6 часов на 47,5% (p<0,01).

Рисунок 1 – Содержание гормонов гипофизарно-надпочечниковой системы у животных, перенесших 5- минутную острую кровопотерю

На 7 сутки восстановительного периода, концентрация гормона в сыворотке крови экспериментальных животных не имела существенных различий с данными, установленными до начала эксперимента. Степень снижения показателя относительно максимального уровня составляла 62,1% (p<0,01).

При изучении содержания кортизола установлено, что к 1-му часу после перенесенной острой кровопотери продолжительностью 5 минут, его уровень в сыворотке крови имел недостоверную тенденцию к росту относительно исходных показателей.

В последующие сроки наблюдения отмечалось дальнейшее повышение содержания данного гормона в сыворотке крови у крыс.

Так, через 3 часа восстановительного периода уровень кортизола превышал концентрацию в сыворотке крови, зарегистрированную в 1-ый час, на 14,3%. Полученные результаты были достоверно выше на 35,6% (p<0,05) исходных величин.

К 6-му часу после перенесенной острой кровопотери содержание кортизола высокодостоверно превысило показатели, зарегистрированные в исходном состоянии (на 66,1%, p<0,01). Зарегистрированный уровень гормона был выше данных 1-го часа наблюдения на 39,9% (p<0,05), а уровня, зарегистрированного через 3 часа – недостоверно.

Через сутки после моделирования терминального состояния уровень кортизола в сыворотке крови крыс еще несколько повысился и превышал на 84,6% (p<0,01) данные, зарегистрированные у интактных животных. Достоверные различия прослеживались также с величинами, определенными через 1 час, 3 и 6 часов посттерминального периода (p<0,01, p<0,05, p<0,05 соответственно).

При обследовании на 3 сутки после моделирования терминального состояния содержание кортизола в сыворотке крови было наиболее высоким и превышало среднее значение в группе интактных животных на 123,6% (p<0,01), зарегистрированное в 1 час – на 88,4% (p<0,01), а данных 3-го часа наблюдения – на 65,0% (p<0,01).

Несмотря на то, что к 7 суткам периода после моделирования терминального состояния (168 часов) наблюдалась тенденция к снижению содержания кортизола, его уровень оставался выше исходных величин на 75,1% (p<0,01).

Кроме того, среднее содержание кортизола в сыворотке крови, зарегистрированное к 7 суткам постгеморрагического периода, превышало данные, определенные через 1 час, на 47,8 (p<0,05).

Также в этот срок уровень кортизола был выше содержания гормона, зарегистрированного к 3-му часу на 29,3% (p<0,05) и не имел существенных различий со средними величинами, зарегистрированными через 6 часов и 1 сутки.

Таким образом, для посттерминального периода характерна фазная динамика содержания АКТГ с нарастанием уровня гормона до 6 часа после моделирования острого кровотечения с летальным исходом и восстановления жизнедеятельности и сутки от начала моделирования острой кровопотери и снижением практически до уровня интактных животных на 7-е сутки постгеморрагического периода. По-видимому, отмечаемые в постгеморрагическом периоде изменения содержания гормонов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы являются одним из факторов, приводящих к повышенной летальности животных на 1-е и 7-е сутки.

При определении содержания катехоламинов в эритроцитах (рисунок 2) было установлено, что к 1 часу после моделирования острой кровопотери их уровень увеличивался 2,23 раза (p<0,001) относительно исходных величин.

Рисунок 2 – Динамика содержания катехоламинов в эритроцитах

В последующие сроки постгеморрагического периода наблюдалась тенденция к снижению цитохимического индекса.

Так, результаты, полученные через 6 часов после моделирования терминального состояния, превышали данные, зарегистрированные у интактных животных, на 93,7% (2,41±0,17, p<0,01). При этом цитохимический индекс был ниже на 13,2% величин, зарегистрированных к 1 часу эксперимента.

В срок наблюдения 1 сутки содержание катехоламинов в эритроцитах продолжало снижаться. Причем средний цитохимический коэффициент, наблюдаемый через 24 часа (2,25±0,20, p<0,001) был еще на 60,7% выше показателя интактных животных (p<0,01), но на 27,9% ниже средней величины, зарегистрированной через 1 час (p<0,05).

На 3-и сутки восстановительного периода содержание катехоламинов в эритроцитах снизилось на 32% (1,83±0,14, p<0,01) по сравнению с данными 1-го часа постгеморрагического периода. При сопоставлении с результатами цитохимического индекса, наблюдаемого через 3 часа после моделирования острой кровопотери, выявлено, что данные по содержанию катехоламинов в эритроцитах в изученный период времени были ниже в 1,3 раза (p<0,05).

Через 72 часа после моделирования терминального состояния путем острой кровопотери величины цитохимического индекса были ниже показателей, зарегистрированных к суткам восстановительного периода, на 18,7%. Однако средний цитохимический индекс оставался выше на 30,8% (p<0,05) данных, полученных в группе интактных животных.

Через 168 часов содержание катехоламинов в эритроцитах продолжало уменьшаться и практически не отличалось от определенного у интактных животных. Снижение величин среднего цитохимического индекса по сравнению с данными первого часа восстановительного периода составило 41,6% (p<0,01).

Сопоставление результатов, полученных в максимуме кривой – через 3 часа и через 168 часов показало, что содержание катехоламинов в эритроцитах в динамике постгеморрагического периода снизилось на 58,7% (p<0,001).

Таким образом, изменения со стороны гипофизарно-надпочечниковой системы после перенесенной острой кровопотери, характеризуется фазностью динамики уровня АКТГ с подъемом, достигающим максимума в срок 6 часов и монофазным снижением, начиная с первых суток.

Содержание кортизола в крови достоверно нарастало в динамике до 3 суток, и снизилось только через 168 часов эксперимента, а концентрация катехоламинов в эритроцитах достигала максимума через 3 часа и потом плавно снижалась.

Выявленные изменения со стророны гормонов гипофизарно-надпочечниковой системы, бесспорно, оказывали своё влияние на резистентность организма, поскольку на мононуклеарных клетках крови, на альвеолярных макрофагах человека обнаруживаются рецепторы для глюкокортикоидов.
Влияние острой кровопотери на систему крови и иммунную резистентность организма

Как видно из данных представленных, в таблице 1, к суткам после перенесенной острой кровопотери, количество бластов уменьшилось на 39% (p<0,01) относительно показателей интактных животных.

Однако на 7-е сутки содержание данных клеток увеличилось в 1,9 раз (p<0,01) по сравнению с предыдущими результатами и находилось в пределах контрольных величин.

Что касается промиелоцитов, то через сутки восстановительного периода их количество возросло на 64,4% (p<0,001) по отношению к показателям интактных животных. К 7-м суткам, напротив, отмечалось их снижение в 2,4 раза по сравнению с величинами 24 часа наблюдения. Полученные данные достоверно не отличались от результатов группы интактных крыс.

Через 24 часа после моделирования острой кровопотери наблюдалось увеличение количества миелоцитов на 28% по отношению к контрольным величинам. На 7 сутки установлено их снижение в костном мозге как по сравнению с величинами 1-х суток, так и данными, зарегистрированными до начала эксперимента. На 1 сутки после эксперимента наблюдалось снижение содержания юных нейтрофилов в костном мозге в 2,25 раза по отношению показателей контрольной группы. Однако на 7 сутки после моделирования острой кровопотери отмечалась тенденция к увеличению количества юных нейтрофилов на 17,5% относительно данных первых суток, а в сравнении с данными, зарегистрированными до начала эксперимента было ниже в 1,9 раза (p<0,02).

Таблица 1 – Влияние 5-ти минутной острой кровопотери на клеточный состав костного мозга крыс (М±m)

На протяжении всего периода наблюдения отмечалась тенденция к увеличению палочкоядерных нейтрофилов в костном мозге.

Что касается сегментоядерных клеток, то через 24 часа после моделирования острой кровопотери, их количество снижалось на 38,4% (p<0,02) по сравнению с показателями интактных крыс. Однако к 7 суткам эксперимента их содержание возросло в 2,4 раза (p<0,001) относительно данных 1 суток, и было в 1,5 раз выше (p<0,02) контрольных величин. После перенесенной острой кровопотери наблюдалась тенденция к снижению количества эозинофилов к 7-м суткам. Через 24 часа после острой кровопотери отмечалось уменьшение в 1,9 раз содержания моноцитов в костном мозге, а на 7-е сутки их количество находилось в пределах данных интактных животных.

На протяжении всего постгеморрагического периода наблюдалась тенденция к росту содержания лимфоцитов в костном мозге экспериментальных животных. В течение всего восстановительного периода содержание базофилов в костном мозге находилось на одном уровне с исходными показателями. В то же время, процент базофильных нормоцитов снижался, достигая минимальных значений к 7-м суткам эксперимента. При этом их количество было ниже на 62% (p<0,05) контрольных величин.

Проведенное моделирование острой кровопотери не повлияло на содержание плазматических клеток в костном мозге животных.

Таким образом, терминальное состояние, моделируемое путем острой кровопотери, создает все условия для нарушения в постгеморрагическом периоде темпов размножения, дифференцировки и соотношения различных ростков гемопоэза и его полноценности. Наблюдаемая гиперплазия гранулоцитарного ростка свидетельствует о выходе гранулоцитов из костного мозга в циркулирующую кровь. Отмечаемый лимфоцитоз обусловлен, по-видимому, усилением миграционных процессов этих клеток в костный мозг.

Из костного мозга предшественники Т-лимфоцитов циркулируют в тимус, где происходит их дифференцировка и созревание. Однако, не смотря на центральное место, которое занимает вилочковая железа в иммунном ответе, содержание иммуннокомпетентных клеток и распределение субпопуляций лимфоцитов в тимусе после перенесенной острой кровопотери остается наименее изученным.

Выполненные исследования позволили установить, что для постгеморрагического периода характерно уменьшение тимического индекса. Однако к 1 суткам постгеморрагического периода данный показатель уменьшался на 30,4% (p<0,05). Через неделю после острой кровопотери наблюдалось дальнейшее снижение изучаемого показателя, при этом тимический индекс был меньше исходного показателя в 1,7 раз (p<0,02) и равнялся 1,19±0,25.

Одновременно со снижением тимического индекса изменялось клеточность органа. К суткам постгеморрагического периода количество клеток в тимусе уменьшилось на 48% по отношению к показателям контрольной группы (p<0,001). Через 3 суток после острой кровопотери общая клеточность органа составляла 50% (p<0,001) от величин показателей интактных животных.

К 7 суткам восстановительного периода общая клеточность тимуса продолжала снижаться и была ниже контрольных величин в 2,6 раз (p<0,001).

В таблице 2 представлены данные, полученные при анализе содержания лимфоцитов различных кластеров дифференцировки в тимусе. При этом клетки, которые не относились ни к Т-, ни к В-лимфоцитам по исследованным кластерам, отнесены нами к 0-лимфоцитам (ранние формы). При этом представлены относительные значения содержания исследованных клеток. Абсолютные значения соответствуют данным, представленным в таблице 2, срока «лимфоциты».

Количество лимфоцитов в тимусе, как показано в таблице 2, имело динамику к уменьшению. Данные изменения связаны с миграцией лимфоцитов из области их депонирования (к числу которых у животных, в отличие от человека, относится тимус). При этом уменьшение клеточности тимуса происходило преимущественно за счет снижения содержания функциональных (зрелых) иммунокомпетентных клеток.

Так, на первые сутки после моделирования относительное содержание CD3+ клеток снижалось относительно исхода на 43,7% (p<0,01). На третьи сутки отмечалась тенденция к росту данного показателя, не имеющего достоверных различий с уровнем на первые сутки. На седьмые сутки было выявлено повторное снижение содержания CD3+ клеток в тимусе, которое было достоверно как по отношению к среднему исходному показателю, так и к уровню, имевшемуся на третьи сутки после острой кровопотери (на 46,9%, p<0,01 и на 20,1%, p<0,05).

Снижение относительного содержания CD3+ клеток реализовывалось в большей степени за счет уменьшения числа CD4+ лимфцитов. Клетки данного кластера дифференцировки выполняют функцию Т-хелперов, т.е. обеспечивают свойства памяти и стимуляции пролиферации и дифференцировки. Степень снижения относительного содержания клеток данного кластера дифференцировки в тимусе через 1 сутки составила 50,8%, через трое суток – 40,4%, а на седьмые сутки показатель был наиболее низким, а различия его с исходом достигали 54,7% (p<0,01; p<0,05; p<0,01 соответственно). Кроме того, достоверное снижение на седьмые сутки было зарегистрировано по отношению к третьим суткам развития постгеморрагического состояния.

В несколько меньшей степени на протяжении всего периода исследования было снижено содержание CD8+ клеток. Различия с исходным показателем (уровнем содержания у интактных животных) были достоверны в сторону снижения во все три срока и составляли, соответственно, 26,5%, 18,7% и 29,4% (p<0,05 во всех случаях).

Относительное содержание CD19+ клеток имело достоверные различия с исходным показателем только на первые и третьи сутки (на 22,6% и 16,1% соответственно). На седьмые сутки отмечалось превышение над показателем третьих суток на 16,9% (p<0,05).

Ввиду более значительного уменьшения содержания в тимусе CD4+ лимфоцитов отмечалось достоверное уменьшение средней величины соотношения CD4+/CD8+. Через 1 сутки после моделирования стресса было выявлено снижение средней величины показателя на 33,2%, на третьи сутки – на 26,5% от исходного, на седьмые сутки отмечалась дальнейшая динамика к уменьшению индекса, составившая 35,9% в отношении интактных животных (p<0,05) и 12,8% - с показателем на третьи сутки.

Абсолютное и относительное снижение содержания дифференцированных лимфоцитов в тимусе соответствовало повышению относительного числа недифференцированных форм, не несущих маркеров Т- и В-клеток. Достоверное превышение относительного показателя их содержания сохранялось на всём протяжении проведенного исследования. Различия с исходом в сторону превышения достигали 34,3%, 28,1% и 34,6% соответственно (p<0,05 во всех случаях).

Таким образом, при острой кровопотере со стороны механизмов клеточного звена иммунной системы в тимусе было выявлено уменьшение содержания CD3+, CD4+ клеток. Следует учитывать тот факт, что преимущественно из органов, обеспечивающих дифференцировку, подготовку и депонирование иммунокомпетентных клеток, в том числе из тимуса, в первую очередь мигрируют дифференцированые, функционльно активные лимфоцитоы, несущие соответствующие иммунные маркеры кластеров дифференцировки. Соответственно, при моделировании стресса, связанного с острой кровопотерей, были получены адекватные данные по измнениям клеточного состава тимуса.

Таким образом, в постгеморрагическом периоде отмечается уменьшение массы тимуса, сочетающееся со снижением содержания в органе иммунокомпетентных клеток.

Для уточнения динамики показателей клеточности селезенки и соотношений содержания различных иммуноцитов в данном органе в динамике состояния после острой кровопотери нами был предпринят соответствующий анализ.

В результате получены данные, представленные в таблице 3.

Во все сроки после острой кровопотери содержание лимфоцитов, несущих маркеров кластеров дифференцировки, в селезенке было снижено по отношению к состоянию у интактных животных.

Степень относительного снижения содержания CD3+ клеток была наибольшей на третьи сутки после перенесенной острой кровопотери, когда она составляла 55,3% по отношению к интактным (p<0,01). Различие с контролем на седьмые сутки было менее выраженным и составило 49,4% (p<0,05).

В ещё большей степени снижалось содержание CD4+ клеток. Различия с интактными через одни сутки составили 59,3% (p<0,01). На третьи и седьмые сутки отмечалось ещё более значительное уменьшение относительного показателя, превышающее 60% (p<0,01) (рисунок 10).

В меньшей степени изменялось содержание CD8+ клеток. Наибольшие различия по данному показателю с интактными отмечались через трое суток после острой кровопотери и составляли 39,4% (p<0,05). Уже на седьмые сутки отмечалась значительная динамика к восстановлению уровня клеток данного кластера, достигающая 30,5% в сравнении с третьими сутками. Достоверных различий с интактными в этот срок не было.

В отношении содержания CD19+ отмечалось наличие достоверного снижения во все три срока исследования после острой кровопотери, причем наименьшее значение было определено на седьмые сутки (рисунок 11).

Динамику к постепенному уменьшению имела и величина иммунорегуляторного индекса. Если на первые сутки по отношению к интактным животным она была ниже на 35,2%, то на третьи сутки – на 36,4% (p<0,05), а на седьмые – на 50,7% (p<0,01). Достоверными были и различия между третьими и седьмыми сутками (p<0,05).

Относительное содержание нулевых лимфоцитов в селезенке было соответственно повышенным.

Степень превышения над группой интактных на первые сутки составляла 79,0%, на третьи сутки – 75,9% и на седьмые сутки – 76,2% (p<0,01 во всех случаях).

В таблице 4 показаны изменения содержания иммунокомпетентных клеток в крови у экспериментальных животных в разные сроки после острой кровопотери, 5-минутного пребывания в состоянии клинической смерти и реанимации.

После 5-минутной острой кровопотери отмечалась лишь умеренная динамика относительного содержания иммунокомпетентных клеток в крови.

Так, по общему содержанию Т-лимфоцитов была зарегистрирована лишь умеренная тенденция к превышению относительного содержания над показателями интактных животных. При этом существенной динамики с первых по седьмые сутки наблюдения выявлено не было.

Также не отмечалось сколь-нибудь значительных изменений содержания CD4+ клеток. По данному показателю отмечалась очень ограниченная тенденция к росту.

Не было выявлено достоверных различий с показателями контрольной группы и по относительному содержанию CD8+ лимфоцитов. Вначале оно умеренно повышалось, а затем снизилось до исходного уровня.

Во все сроки обследования было зарегистрировано достоверное снижение относительной величины В-лимфоцитов (CD19+). Различия с интактными животными через одни сутки после кровопотери составили 34,7% (p<0,01), на третьи сутки – 32,5% (p<0,05) и на седьмые сутки 21,8% (p<0,05).

В первый срок иммунологического обследования у животных, подвергшихся кровопотере, была зарегистрирована тенденция к снижению средней величины соотношения CD4+/CD8+, а на третьи и седьмые сутки – к росту.

Содержание нулевых клеток оказалось достоверно большим, чем у интактных во все 3 срока. Различия составляли 60,6%, 71,8% и 33,5% соответственно (p<0,05 во всех случаях). Отмечалась динамика к снижению показателя на седьмые сутки в сравнении с третьими, различия составили 22,6% (p<0,05).

В таблице 5 представлены данные о динамике содержания некоторых цитокинов в периферической крови у экспериментальных животных.
Таблица 5 - Содержание иммунорегуляторных цитокинов в крови после 5-минутной острой кровопотери в эксперименте

Заметно, что динамика исследованных показателей была в значительной степени разнонаправленной. Так, во все три срока обследования животных, подвергавшихся острой кровопотере, было выявлено увеличение содержания мощного провоспалительного цитокина ФНОα в сравнении с интактными животными. Степень превышения данного показателя над контролем была наибольшей на третьи сутки, когда достигала 142,2% (p<0,05). Достоверными были и различия с интактными на первые и третьи сутки, когда они достигали 78,2% и 127,5% соответственно (p<0,05 в обоих случаях).

Динамика содержания IL-2 на 1 сутки была направлена, напротив, на снижение. При этом обследование в 1 сутки после острой кровопотери показало наличие достоверных различий с группой интактных животных (на 27,0%, p<0,05), на 3 сутки отмечалась практическая нормализация исследованного показателя. Наиболее высокое и достоверно повышенное значение было выявлено на 7 сутки (различия по отношению к интактным животным – 31,9%, к показателю на 3 сутки – 37,7%, p<0,05 в обоих случаях). Совершенной иной была динамика содержания в крови IL-10, обладающего противовоспалительным действием. Во все сроки после острой кровопотери оно оказалось достоверно сниженным в сравнении с интактными животными и имело динамику, направленную на дальнейшее уменьшение. Степень различий по данному показателю с уровнем контрольной группы на 1 сутки после кровопотери достигало 32,9%, на 3 сутки – 65,0% и на 7 сутки – 67,4% (p<0,05; p<0,01; p<0,01).

Изменения стимулированного и спонтанного НСТ-теста в постгеморрагическом периоде, оказали свое влияние на индекс стимуляции, результаты которого на 1-е сутки после острой кровопотери снижались на 71,9% (p<0,001) относительно контрольных величин.

К 3 суткам отмечалось увеличение показателя индекса стимуляции, однако полученные результаты оставались ниже в 2,6 раз (p<0,01) исходных показателей. Через неделю после острой кровопотери наблюдалось повторное уменьшение индекса стимуляции, при этом показатель, отражающий способность клеток синтезировать ИЛ-1, был ниже контрольного на 70%.

При изучении влияния острой кровопотери на фагоцитарную активность микро- и макрофагов было установлено, что через сутки после моделирования острой кровопотери у крыс происходило резкое снижение фагоцитарной активности клеток на 48,9% (p<0,001) относительно исходных величин.

Фагоцитарное число, увеличиваясь на 1 сутки восстановительного периода в 1,5 раз (p<0,05) по сравнению с исходными величинами, достигало своего максимума на 7 день эксперимента (выше в 1,9 раза, p<0,001 показателей контроля.

Через 1 сутки после моделирования острой кровопотери в периферической крови крыс наблюдался рост содержания ЦИК. На 3 день эксперимента их уровень превышал в 2,1 раз (p<0,001) показатели 1 суток и в 2,6 раз (p<0,001) результаты, установленные до начала эксперимента. Однако, через неделю после острой кровопотери ЦИК снижались на 55,6% (p<0,001) относительно данных 3 суток, достоверно не отличаясь, от исходных величин.

Таким образом, изменения гормональной регуляции со стороны гипофизарно-надпочечниковой системы после острой кровопотери обусловливают снижение Т- и В-клеток, увеличение количества 0-лимфоцитов, уменьшение иммунорегуляторного индекса, повышение показателей НСТ-теста, угнетение фагоцитарной способности клеток, сочетающийся со снижением катионных белков и повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов.

Кроме прямого анализа динамики показателей симпато-адреналовой (катехоламины) и адрено-кортикальной системы (кортизол) и исследования состояния различных звеньев иммунной системы в динамике стресса после перенесенной кровопотери нами был проведен анализ корреляций между ними в ходе развития стресса и оценка особенностей изменений показателей иммунной системы в зависимости от степени реакции регуляторных систем.

При проведенном анализе во все сроки обследования были выявлены достоверные и практически однонаправленные особенности корреляций показателей иммунной системы с параметрами гуморальной регуляции, определяющими течение стрессорной реакции.

При следующем обследовании, проведенном через 72 часа, направленность корреляционных взаимосвязей между содержанием катехоламинов и показателями иммунной системы переменила знак. Корреляции оказались прямыми и в большинстве случаев достоверными. Наиболее значительные показатели степени корреляции (p<0,05) в этот срок обследования были выявлены с концентрацией ФНОα, а также с фагоцитозом.

В срок обследования 7 суток отмечалось уменьшение степени прямой сопряженности катехоламиновой регуляции и показателей «молодых» компонентов иммунной системы. как мы считаем, это происходило за счет выхода стресс реакции в этот срок из под контроля симпато-адреналовых механизмов т возвращения нормального баланса в ВНС.

Аналогично, не было выраженных взаимосвязей между содержанием в крови АКТГ и большинством иммунных механизмов. Сохранялось наличие ряда достоверных корреляционных связей, характеризующих негативное влияние кортизола на показатели иммунитета, главным образом, его клеточного звена.

В таблицах 6 и 7 представлены особенности динамики показателей иммунной системы в зависимости от реактивности симпато-адреналовой и адрено-кортикальной системы на стресс.
Таблица 6 - Особенности динамики некоторых иммунных показателей в зависимости от степени реакции симпато-адреналовой системы

Было выявлено практическое отсутствие различий по содержанию в периферической крови Т-лимфоцитов, иммунорегуляторному индексу. С другой стороны, относительное количество CD19+ клеток имело тенденцию к росту только в подгруппе со значительным повышением содержания катехоламинов и не изменялось – при умеренном повышении.

Весьма существенные различия были выявлены также по концентрации в крови ФНО. В исходе иммунологического обследования оно было достоверно выше при значительном повышении катехоламинов в крови, а через 7 суток – относительно ниже, чем во второй выделенной подгруппе. Через 1 сутки концентрация IL-10 в подгруппе умеренного повышения содержания катехоламинов не имела достоверных различий с группой интактных животных, а во второй сравниваемой подгруппе – резко снижалась. Напротив, через 7 суток более выраженное уменьшение концентрации IL-10 было определено в группе умеренного повышения содержания катехоламинов.

Не было достоверных различий по концентрации ЦИК в крови исследованных животных через 1 сутки. Напротив, через 7 суток имелось значительное превышение их в первой подгруппе. Фагоцитарная активность нейтрофилов в группе умеренного повышения содержания катехоламинов в оба срока обследования была выше, чем подгруппе сравнения.

Таким образом, значительная активация гуморальных механизмов симпато-адреналовой системы при острой кровопотере способствует повышению провоспалительной активности в юных, регуляторно-клеточных звеньях иммунной системы и соответствует скорее подавлению, чем активации фагоцитарных механизмов. Эти данные следует учитывать при разработке иммуномодулирующей терапии в различных клинических ситуациях.
Таблица 7 - Особенности динамики некоторых иммунных показателей в зависимости от степени реакции адрено-кортикальной системы

Видно, что в срок исследования 72 часа в подгруппе экспериментальных животных со значительным повышением содержания кортизола в периферической крови практически все исследованные иммунологические показатели (кроме содержания IL-10 и ЦИК) были ниже, чем в группе сравнения. Напротив, через 7 суток отмечалось превышение содержания Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, ФНО, IL-10 и ЦИК в крови, что свидетельствует более об активации, чем об угнетении иммунитета. Учитывая ранее полученные данные о наличии корреляции между различными показателями иммунной системы и функционального состояния симпато-адреналовой и адрено-кортикоидной системы, а также динамику регуляторных факторов иммунитета (цитокинов) мы полагаем, что реактивация функции эффекторных звеньев иммунитета происходит за счет более выраженного развития компенсаторных реакций при подавлении иммунитета, связанного с повышенной продукцией и выбросом в кровь кортизола. Данные изменения обеспечивают сохранение функциональной способности иммунитета при различных формах стресса, в том числе терминальных состояний, связанных с острой кровопотерей.