Морфологические методы doc


Приготовление целлоидиновых срезов



страница10/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   30

Приготовление целлоидиновых срезов


Для приготовления целлоидиновых срезов используют ножи типа А и Б. Целлоидиновые блоки закрепляют так же, как и па- рафиновые. После установки ножа в микротом к нему пододви-

гают объектодержатель с укрепленным в нем блоком. Выравни- вают поверхность блока до тех пор, пока полностью не обнажит- ся ткань кусочка, а затем приступают к приготовлению срезов желаемой толщины. Во время резания нож и объект обильно сма- чивают 70% или 80% спиртом, пользуясь кисточкой. Нож по са- лазкам микротома ведут плавно, без давления. Полученный срез расправляют на ноже с помощью кисточки, после чего срез сни- мают с ножа на подушечку указательного пальца, подложенного под нож. Срезы кладут в склянки с 70% спиртом.


Подготовка предметных стекол


Предметные стекла, применяемые для получения гистоло- гических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специ- ально упакованные импортные предметные стекла. Предмет- ные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2-3% рас- творе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вы- мытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова: 96% спирт и эфир (1:1). Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку. Для обезжиривания предметных стекол используют также хромовую смесь, в состав которой входят 100 г бихромата калия, концен- трированной серной кислоты и 1000 мл горячей воды. Бихромат калия растворяют сначала в горячей воде, затем раствор охлаж- дают и после этого по стеклянной палочке осторожно по каплям добавляют серную кислоту. Стекла выдерживают в хромовой смеси 2-3 дня, а затем тщательно промывают в проточной воде в течение 1-2 дней. Предметные стекла также хорошо обезжирива- ются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают.

Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю. Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазыва- ют смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают

и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистил- лированной водой, затем размешивают с равным объемом глице- рина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и 6 мл 5% формалина. После фильтрации смесь готова к на- несению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окраши- вании не образуется фон. Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином. В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и пе- ремешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают сре- зы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло. Этот способ дает неизменно хороший эф- фект, и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка.




    1. ОКРАСКА СРЕЗОВ




    1. Классические (общие) методы окраски





      1. Окраска гематоксилин-эозином

Гематоксилин и эозиновая окраска – наиболее распростра- ненный метод окраски срезов. Он хорошо выявляет клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Даже если при- меняют специальные методы окраски, параллельно окрашивают несколько срезов и гематоксилином с эозином. Основной краси- тель гематоксилин окрашивает ядра, кислый краситель эозин – цитоплазму и неклеточные структуры. Гематоксилин – это вы- тяжка из кампешевого дерева (Америка), эозин – искусственный краситель. Чтобы получилась краска, гематоксилин окисляют, и он превращается в гематеин. В соединении с некоторыми солями гематеин дает четкое окрашивание ядер. Широко применяется квасцовый гематоксилин, часто используется гематоксилин Май- ера.

Приготовление квасцового гематоксилина Эрлиха. В 100 мл 96% спирта растворяют 2 г гематоксилина. К раствору добав- ляют 100 мл дистиллированной воды, 3 г калийных квасцов, 10 мл ледяной уксусной кислоты. Квасцы должны быть химически чистыми. Для полного окисления гематоксилина и образования гематеина приготовленный раствор в течение 15 дней выдержи- вается на свету при доступе воздуха. Раствор приобретает темно- красный цвет. Готовый (созревший) раствор может долго хра- ниться в банках с притертыми пробками. Можно сразу раство- рить 0,5 г сухого гематеина в 100 мл 96% спирта, а затем доба- вить остальные вещества. Тогда не надо проводить "дозревание".

Приготовление гематоксилина Майера. В 1 л дистилли- рованной воды растворить 1 г гематоксилина, добавить 0,2 г йод- нокислого натрия и 50 г калийных квасцов и перемешать. После полного растворения он становится фиолетово-синим. В раствор добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты, и он становится фиолетово-красным. Раствор сразу го- тов к употреблению, хорошо сохраняется.

Эозин – цитоплазматический краситель, который использу- ется в виде спиртовых или водных растворов. Для приготовления эозина 0,1 г красителя растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Перед применением краски профильтровывают.

Для окрашивания гематоксилином парафиновые и целлои- диновые срезы специальной подготовки не требуют. Заморожен- ные срезы помещают в спирт на 3-5 мин., затем переносят в воду (срезы обезжириваются и лучше красятся). Окраску проводят сначала гематоксилином. Из воды срезы переносят в раствор кра- сителя (в стаканы, бюксы, на часовое стекло) или капают краси- тель на предметное стекло. Созревший раствор дает хорошие ре- зультаты через 2-3 мин. На первых срезах определяют продолжи- тельность окраски, а затем строго выдерживают ее. Из гематоксили- на срез переносят в дистиллированную воду. Если окраска удалась, ядра клеток имеют интенсивную красновато-фиолетовую окраску, в них хорошо видны ядрышки и глыбки хроматина, цитоплазма не окрашена. При слабой окрашенности ядер нечетко видна структура, в этом случае время окрашивания увеличивают. При черной окраске ядер время окрашивания уменьшают. Если гематоксилин окраши- вает срезы очень быстро и ядра перекрашиваются – применяют

метод ослабления. Для этого срезы переносят на несколько се- кунд в слабый раствор соляной кислоты в 70% спирте (5-6 капель крепкой кислоты на 100 мл спирта), при этом усиливается крас- ный оттенок. В большинстве случаев достаточно опустить срез в солянокислый спирт на 1-2 с., чтобы ослабить окраску до нужно- го тона. После дистиллированной воды срезы переносят в про- точную воду (имеет щелочную реакцию), в которой они синеют через 10-15 мин. Затем их помещают на 5 мин. в дистиллирован- ную воду, потом в раствор эозина на 2-3 мин. (продолжитель- ность окраски определяют под контролем микроскопа). При удачной окраске срез имеет равномерный желто-розовый цвет, на фоне которого выделяются синие ядра. Если эозин окрашивает срезы слабо, его подкисляют уксусной кислотой (одна капля 3% кислоты на 100 мл эозина). При перекрашивании (фон – интен- сивно красный, ядра выделяются нечетко) уменьшают время ок- рашивания. После эозина срезы переносят на 1 мин. в дистилли- рованную воду, обезвоживают в спиртах, через карбол-ксилол за- ключают в канадский бальзам.

Существует много других ядерных и фоновых красителей, дающих хорошие результаты. Гематоксилин Эрлиха можно заме- нить гематоксилином Вейгерта, Майера и др. Ядра можно окра- сить метиленовым синим, кармином и др. В качестве фонового красителя можно использовать оранжевый G, светло-зеленый и т.п.




Поделитесь с Вашими друзьями:
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница