Морфологические методы doc


Окраска железным гематоксилином по методу Гейденгайна



страница11/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   30

Окраска железным гематоксилином по методу Гейденгайна


Железный гематоксилин – хороший и часто используемый краситель. Он позволяет выявить тонкие детали ядер, пригоден для изучения деления клеток. Качество окраски зависит от ее длительности. Окрашивать можно после любой фиксации, но ре- зультаты лучше после фиксации в сулемовых и хромовых фикса- торах. Железным гематоксилином сначала перекрашивают объ- ект, а потом ослабляют до нужного тона. Им окрашивают срезы только после протравки. Перед окрашиванием готовят три рас- твора: протраву, краситель и ослабляющую (дифференцирую- щую) жидкость.

Протрава представляет собой 2,5% раствор железоаммиач- ных квасцов в дистиллированной воде. Пригодны только твер-

дые, прозрачные, бледно-фиолетовые кристаллы. Другой цвет квасцов свидетельствует об их разрушении. Если разрушение за- тронуло только поверхность кристаллов, их очищают от белой и желтоватой массы, слегка обмывают водой и используют.

Краситель: растворяют 0,5 г гематоксилина в 10 мл абсо- лютного или 96% спирта. В раствор доливают 90 мл дистиллиро- ванной воды. Раствор дозревает на свету в банке, прикрытой марлей в течение месяца (пока не станет темно-коричневым). По мере подсыхания раствора в него доливают дистиллированную воду. Если к смеси добавить 0,1 г йодноватокислого натрия (NaIO3), то раствор пригоден для окрашивания сразу после при- готовления.

Ослабляющая жидкость – это 1% раствор железоаммиачных квасцов в дистиллированной воде.

Обработка срезов начинается с протравливания в растворе квасцов. Экспозиция длится 6-24 ч. в зависимости от толщины срезов и температуры. При 45-50°С достаточно 1-2 ч. Парафино- вые срезы толщиной 4-6 мкм протравливают 4-6 ч., при 50°С - 35 мин. Срезы толщиной 10-15 мкм выдерживают 7-12 ч., при 50°С - 1 ч. Тотальные пленочные препараты – соответственно 24 и 2 ч. Эти цифры приблизительны. В каждом случае следует опреде- лять продолжительность обработки опытным путем. Из протравы срезы переносят в дистиллированную воду. Окрашивание про- должается 6-24 ч., при 45- 50°С – 1-2 ч. Срезы лучше перекра- сить. После окрашивания черные срезы промывают 10-15 мин. в дистиллированной воде, меняя ее три раза. Продолжительность дифференцирования зависит от задач исследования. Как правило, быстрее исчезает краска из цитоплазмы, в первую очередь экто- плазмы. Клеточные границы, органеллы, разные базофильные включения остаются интенсивно окрашенными. Последними те- ряют краску ядра, ядрышки и глыбки хроматина. Желаемая окра- ска достигается контролем процесса дифференцирования с по- мощью микроскопа. Если просветление протекает слишком мед- ленно, увеличивают концентрацию квасцов до 2,5%. Если требу- ется замедлить дифференцировку, ослабляющую жидкость раз- бавляют дистиллированной водой. После окончания дифферен- цировки срезы промывают в проточной воде, обезвоживают и за- ключают в канадский бальзам. Существует быстрый метод окра-

ски срезов железным гематоксилином Гейденгайна. Реактивы го- товят как обычно. Срезы, вынутые из дистиллированной воды на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой. Рас- твор железоаммиачных квасцов (2,5%) наливают на срез, стекло нагревают над спиртовкой до появления пара. Когда пар переста- нет появляться, операцию повторяют (трижды). Затем раствор сливают и без промывки на стекло наливают гематоксилин. Стекло подогревают до появления пара. Срез становится сине- черным. Его промывают дистиллированной водой, затем налива- ют раствор квасцов. Стекло помещают на столик микроскопа и контролируют ход осветления до получения требуемой окраски. Потом срез промывают в дистиллированной воде, меняя ее триж- ды, в проточной воде, обезвоживают и заключают в бальзам. У опытных лаборантов метод дает весьма хорошие результаты.

Рекомендуемые параметры окрашивания срезов Окраска парафиновых срезов


1. Ксилол……………………………………...

2. Ксилол……………………………………...

3. Ксилол……………………………………...

4. Спирты 100, 96, 80, 70…………...…...

5. Вода дистиллированная

6. Гематоксилин………………...…………...



  1. Проточная вода…………….……………..

  2. Вода дистиллированная

1 мин1.

1 мин.


3 мин.

по 2 мин.


2 мин. 45 с.

1 ч.



9. Эозин……………..…………….…………… 5 мин.

10. Вода дистиллированная

11. Спирты 70, 80, 96………..……..……….. быстро.

12. Спирт 100……….....……..………………... 2 мин.




13. Карбол-ксилол…....………………………...

14. Ксилолы 1 и 2 …..………………………….

15. Бальзам.

Окраска замороженных срезов

1. Вода дистиллированная.

5 мин.

5 мин.



2. Гематоксилин………………………………. 30 с. -1 мин.

  1. Промывка проточной водой.


Временные параметры для обезвоживания и окраски отрабатываются опытным путем для каждого вида ткани индивидуально, т.к. уплотнение под воздействием спирта и восприятие красителей для каждой

ткани происходит по-разному.






  1. Вода дистиллированная.

  2. При необходимости дифференцировка солянокислым спиртом (быстро, до порозове- ния).

  3. Вода водопроводная.

  4. Вода дистиллированная.

8. Эозин……………………………...неск. с. –

2 мин.



9. Вода дистиллированная…………………… быстро. 10. Спирт 70, 80……….……………………...

11. Спирт-ксилол (расправить на шпателе).




12. Карбол-ксилол…….………………………..

13. Ксилол……………..………………………..

 Бальзам.

10 мин.


1,5 мин.



Окраска соком черники или аронии. При отсутствии ге- матоксилина его можно заменить соком черники или аронии (черноплодной рябины). Окрашивать срезы соком черники в 1887 г. предложил известный русский гистолог М.Д. Лавдовский. Су- ществует несколько способов приготовления красящего раствора. Свежие ягоды, промытые в воде, пропускают через мясорубку. Массу смешивают с 96% спиртом в соотношении 1:1 и настаива- ют 2 суток. Затем настой процеживают или отделяют с помощью центрифуги. Прозрачная жидкость темно-вишневого цвета хоро- шо сохраняется в темной посуде при комнатной температуре. Для окрашивания срезов используют смесь равных частей жидкости и 2,5% раствора алюмокалиевых квасцов на дистиллированной во- де. Получается стойкий и хороший краситель, который можно сохранять до двух месяцев, добавив в него несколько кристаллов тимола.

Метод окрашивания. Срезы помещают в квасцовый рас- твор черники на 3-5 мин., промывают 5-10 мин. водопроводной водой, переносят на 5-20 с. в 1% водный раствор уксуснокислого свинца (до потемнения и приобретения срезами сине-зеленого цвета), хорошо промывают в водопроводной воде, окрашивают эозином и заключают как обычно. Хорошо окрашенные препара- ты не отличаются от гематоксилиновых. Квасцовый раствор чер- ники допускает окраску и по Ван-Гизону.







      1. Поделитесь с Вашими друзьями:
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница