Морфологические методы doc


Выявление гликозаминогликанов



страница15/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   ...   11   12   13   14   15   16   17   18   ...   30

Выявление гликозаминогликанов


Полисахара – высокомолекулярные сахара, находящиеся в тканях организма. Встречаются как в чистом виде (гликоген), так и в соединении с другими веществами (мукополисахара, муко- протеины, гликопротеины). Гликоген содержится главным обра- зом в печени и мышцах. Мукополисахариды получили свое на-

звание за то, что входят в состав слизеподобных веществ (лат. mucus – «слизь»), в качестве одного из компонентов содержат гексозамин. Их разделяют на нейтральные и кислые. Последние весьма распространены в организме (слизь эпителиев пищевари- тельного тракта и протоков большинства желез, основное веще- ство соединительной ткани и т.д.), их, в свою очередь, разделяют на простые (гиалуроновая кислота) и сложные (мукоитинсерная и хондроитинсерная кислоты, гепарин). Мукополисахариды, проч- но связанные с белком, называют мукопротеинами. Они входят в состав слизеподобных веществ и секрета ряда желез. Полисаха- риды – весьма лабильные соединения, чувствительные к измене- ниям обменных процессов в организме. Они занимают ведущее место в развитии ряда патологических процессов, особенно свя- занных с заболеваниями соединительной ткани. Выявление и анализ состояния полисахаров - важный раздел гистохимии.



        1. Реакция Шиф-йодная кислота (ШИК-реакция)


С помощью этой реакции можно выявить гликогены, му- копротеины, гликолипиды. Готовят следующие растворы:

  1. Реактив Шифа (см. выше).

  2. Сернистую воду: а) к 200 мл дистиллированной воды прибавляют 4 мл концентрированной НС1; б) в 25 мл дистил- лированной воды растворяют 4 г безводного сульфита натрия. Оба раствора сливают.

  3. Раствор калия периодата. 1 г калия периодата или 2,5 г натрия периодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Пригоден материал, зафиксированный в фиксаторе Шаба- даша, спирте, жидкости Карнуа, Ценкера, залитый в парафин

или в виде замороженных срезов.

Методика. Доведенные до воды срезы помещают в рас- твор йодной кислоты на 5-10 мин. или калия перйодата на 20-30 мин., промывают в трех порциях дистиллированной воды по 3- 5 мин. в каждой, чтобы удалить йодную кислоту, и помещают в реактив Шифа на 10-20 мин. Реактив содержат в емкости с крышкой, закутанной в черную бумагу. Затем срезы обрабаты- вают в трех порциях свежеприготовленной сернистой воды по 1-2 мин. в каждой, промывают в водопроводной воде 10 мин., ополаскивают в дистиллированной, ядра докрашивают гема-

токсилином, обезвоживают, просветляют, заключают в бальзам. Результат: вещества полисахаридной природы окрашены в пур- пурно- или лилово-красный цвет. Нейтральные полисахара обычно бывают пурпурно-красными, гликоген – более темный.

Рекомендуемый режим окраски:


  1. Депарафинируют срезы.

  2. Проводят через спирты.

  3. Споласкивают водой.

  4. Окисляют в растворе KIO4 (или NaIO4) 20-30 мин. при комнатной температуре или в растворе HIO4 5-10 мин.

  5. Тщательно отмывают в нескольких сменах дистиллиро- ванной воды.

  6. Окрашивают в реактиве Шиффа при комнатной темпера- туре 20-40 мин.

  7. Промывают в 3 сменах сернистой воды (2% раствор ме- табисульфита натрия на 0,5-1,0 % соляной кислоте) по 2-3 мин.

  8. Промывают дистиллированной водой.

  9. Проводят через спирты, ксилол и заключают в бальзам. Результат: избирательная окраска ШИК-положительных со-

единений в красновато-лиловые тона. При желании срезы докра- шивают квасцовым гематоксилином или световым зеленым; воз- можно сочетание с такими обзорными методами, как метод Мас- сона (Lazarus, 1958).

Раствор KIO4: готовят насыщенный (при комнатной темпера- туре) раствор KIO4. Лучше употреблять растворы, приготовлен- ные в день работы, но можно использовать повторно несколько дней подряд.

Раствор NaIO4: 1-2% раствор на воде.

Раствор HIO4: можно использовать 1% водный раствор. Хра- нится в холодильнике достаточно долго и используется повторно. Перед употреблением подогревают до комнатной температуры.

Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота). Существуют многочисленные прописи приготовления реактива Шиффа (Пирс, 1962). Следует иметь в виду, что полнота выявления ШИК- позитивных соединений в срезе во многом зависит от свойств при- готовленного реактива; в первую очередь от его рН, т. е. от содер- жания в нем соляной кислоты: чем ниже рН, тем бледнее окраска и тем меньше количество окрашенных структур. Поэтому приготов-

ление реактива с добавлением 20 мл 1н HCl на 200 мл 0,5% раствора основного фуксина нам представляется нецелесообразным, несмот- ря на то, что он рекомендуется во многих руководствах по гистохи- мии. Качество раствора определяется также качеством красителя. Поэтому лучше использовать выпускаемый отечественной про- мышленностью «основной фуксин для фуксинсернистой кислоты» или чистый кристаллический солянокислый парарозанилин.

На основании собственного опыта рекомендуем приготовле- ние реактива Шиффа по несколько видоизмененной прописи Ко- лемана (1938): 1) 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды, нагревают до 40-50С; 2) охлаждают раствор до комнатной температуры и добавляют 2 г метабисуль- фита калия (K2S2O5); 3) добавляют (небольшими порциями, пе- ремешивая) 6-8 мл 1н HCl и профильтровывают. Раствор готов к употреблению уже через несколько часов. Хранят в холодильни- ке. Годность – до нескольких месяцев. Перед употреблением по- догревают до комнатной температуры. Окраску ведут путем по- гружения препаратов в реактив, налитый в стаканчик, а не нака- пыванием на срез.

Реактив Шиффа из тионина, окрашивающий в синий цвет, можно приготовить по прописи Van Duijn (1956): 1) 0,5 г тионина растворяют в 250 мл дистиллированной воды и кипятят 15 мин.;



  1. добавляют 250 мл трет-бутанола и 50 мл 1н HCl; 3) затем до- бавляют 5 г K2S2O5. Раствор готов через сутки (обесцвечивания раствора не происходит, но это не вызывает неспецифического окрашивания). Хранят в холодильнике.

Флюоресцирующий реактив Шиффа используют для повы- шения чувствительности метода.

Приготовление реактива: 1) 1 г акрифлавина (трипафлавина) растворяют в 200 мл дистиллированной воды; 2) добавляют 2-3 г метабисульфита калия и доливают до 20 мл 1н HCl (лучше не бо- лее 8-12 мл).





Поделитесь с Вашими друзьями:
1   ...   11   12   13   14   15   16   17   18   ...   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница