Метод с флюоресцирующим реактивом Шиффа

Метод с флюоресцирующим реактивом Шиффа:

1. 
   окисляют в HIO₄;
   
2. 
   промывают дистиллированной водой;
   
3. 
   окрашивают в реактиве Шиффа 20-30 мин. и промывают в
   

4. 
   проводят через абсолютный спирт и заключают в одну из нефлюоресцирующих сред (например, в полистирол);
   
5. 
   исследуют в люминесцентном микроскопе. ШИК-пози- тивные соединения флюоресцируют золотистым светом.
   

1. 
   высушенные мазки крови (сушить 2-3 дня) фиксируют 15 мин.
   

2. 
   обрабатывают 5% хромовой кислотой 60-90 мин.;
   
3. 
   промывают в проточной воде 10 мин.;
   
4. 
   воздействуют 1% бисульфитом натрия 1 мин. и промыва- ют в проточной воде 2 мин.;
   
5. 
   инкубируют мазки 4 ч. при 47 в растворе: вода – 50 мл, бура 5% - 3 мл, основной раствор – 50 мл (основной раствор: уро- тропин 3% - 100 мл, AgNО₃ 5% - 5 мл), выдерживают при ком- натной температуре 48 часов, затем хранят в холодильнике;
   
6. 
   промывают в двух сменах воды и помещают в 0,2% рас- твор хлористого золота на 5 мин.;
   
7. 
   обрабатывают мазки в двух сменах 2% гипосульфита натрия;
   
8. 
   промывают водой;
   
9. 
   докрашивают ядра в 1% сафранине 2 мин.;
   
10. 
    промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. Результат: полисахариды окрашиваются в черный цвет, ядра
    

• 
  в красный.
  

2. Выявление кислых мукополисахаридов по методу Гале (Хейла)

Приготовление рабочего раствора. В 100 мл дважды дис- тиллированной кипящей воды вливают каплями при помеши- вании 8-12 мл 10% раствора хлорного железа. Цвет раствора меняется от коричневого до темно-красного. Раствор охлажда-

ют и с помощью диализа из него удаляют НСl. Для этого можно использовать мешочек из целлофана. В диализованный гидро- ксид железа добавляют 2М уксусную кислоту в соотношении от 1:1 до 3:1. Полученный реактив Хейла пригоден для исполь- зования через сутки. В холодильнике можно хранить несколько месяцев.

Методика. Депарафинированные, доведенные до воды срезы помещают в реактив Хейла на 20-30 мин. при комнатной температуре (реактив можно накапать на срезы в чашках Пет- ри), затем промывают в трех сменах 2М уксусной кислоты по 2- 3 мин. в каждой, обрабатывают 0,5-1 % раствором желтой кро- вяной соли на 1% НС1 в течение 15 мин., промывают водой, обезвоживают спиртами, заключают в бальзам. Результат: кис- лые мукополисахариды окрашены в синий цвет. Срез можно докрасить нейтральным красным, эозином, кислым фуксином.

3. Выявление мукополисахаридов толуидиновым

О наличии тех или иных мукополисахаридов в соедини- тельной ткани при окрашивании толуидиновым синим свиде- тельствует появление метахромазии. Метахромазия – это такая окраска, когда в результате химической реакции между тканью и красителем цвет структур отличается от исходного красителя. Так, толуидиновый синий, азур, тионин и другие окрашивают субстрат, с которым реагируют, не в синий, а в цвета от фиолето- вого до розового. Считается, что при рН 4,0 и ниже метахрома- зию могут давать только кислые мукополисахариды, при рН вы- ше 4,0 – муко- и гликопротеины.

синего в течение 4-6 ч., ополаскивают в дистиллированной воде и сразу исследуют под микроскопом. Результат: метахроматиче- ские вещества красные, розовые (v-метахромазия) или пурпурные (b-метахромазия).

Дифференцировка кислых мукополисахаридов. Кислые муко- полисахариды окрашиваются альциановым синим, коллоидным же- лезом, дают метахроматическую окраску, но не дают положитель- ной ШИК-реакции. Их разделяют на несульфатированные (гиалуро- новая кислота, хондроитин) и сульфатированные (хондроитинсуль- фаты А, В, С, кератинсульфат, гепарин-сульфат, гепарин).

7. Окраска по Галле-Мюллер+ШИК-реакция

1. 
   Приготовить 200 мл физраствора (по 2 баночки): 2 г хло- ристого натрия на 200 мл дистил. воды.
   
2. 
   100 мл тестикулярной гиалуронидазы (на 100 мл – 100 мг гиалуронидазы).
   
3. 
   Срезы, фильтрованные в формолацетате довести до воды через ксилолы, спирты.
   
4. 
   Контрольные срезы инкубировать в физрастворе 3 ч. при температуре 37С.
   
5. 
   Опытные срезы инкубируют в физрастворе 3 ч. при тем- пературе 37С.
   
6. 
   Вода дистиллированная.
   
7. 
   Провести процедуры по Мюллеру:
   

10-15 мин.

Приготовление рабочего раствора: прилить по капле 12 мл 32% раствора хлорного железа к 750 мл кипящей дистиллированной воды. Приготовить раствор: 1,2 мл CH₃COOH в 10 мл воды. Сме- шать раствор хлорного железа и раствор CH₃COOH в соотношении 10:1 (непосредственно перед использованием, рН – не более 2).

8. 
   Промывка в дистиллированной воде по 1 мин. 5 раз.
   
9. 
   Споласкивание срезов в 2 М растворе CH₃COOH (на 1 литр
   

10. 
    Поместить на 10 мин. в 1% раствор желтой кровяной со-
    

11. 
    Тщательно промыть в двух сменах дистиллированной воды.
    

1. 
   Промывка водопроводной водой.
   
2. 
   Провести процедуры по ШИК:
   

• 
  вода дистиллированная;
  
• 
  перйодат натрия……..15 мин.;
  
• 
  вода водопроводная….5 мин. дважды;
  
• 
  вода дистиллированная;
  
• 
  реактив ШИФ………...40 мин.;
  
• 
  сернистая вода………..по 2 мин. 3 раза
  
• 
  вода водопроводная…10 мин.;
  
• 
  вода дистиллированная;
  
• 
  гематоксилин………10-15 мин.;
  
• 
  вода водопроводная…10 мин.;
  
• 
  вода дистиллированная;
  
• 
  спирты, ксилолы;
  
• 
  заключение в бальзам.
  

7. 
   
   Каталог: MU for SRS -> Ветеринарной%20медицины%20и%20технологии%20животноводства -> 03%20Бакалавриат -> Ветеринарно-санитарная%20экспертиза
   Ветеринарно-санитарная%20экспертиза -> Курс лекций по биологии животных в постнатальном онтогенезе для самостоятельной работы
   
   
   
   Скачать 4.42 Mb.
   
   Поделитесь с Вашими друзьями: