Морфологические методы doc


Метод с флюоресцирующим реактивом Шиффа



страница16/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   ...   12   13   14   15   16   17   18   19   ...   30

Метод с флюоресцирующим реактивом Шиффа:


    1. окисляют в HIO4;

    2. промывают дистиллированной водой;

    3. окрашивают в реактиве Шиффа 20-30 мин. и промывают в

1% HCl на 70 этаноле 2 смены по 5 мин.;



    1. проводят через абсолютный спирт и заключают в одну из нефлюоресцирующих сред (например, в полистирол);

    2. исследуют в люминесцентном микроскопе. ШИК-пози- тивные соединения флюоресцируют золотистым светом.

Модификация для окраски мазков крови (Wulff и Wulff, 1964):

  1. высушенные мазки крови (сушить 2-3 дня) фиксируют 15 мин.

метанолом, промывают водой;

  1. обрабатывают 5% хромовой кислотой 60-90 мин.;

  2. промывают в проточной воде 10 мин.;

  3. воздействуют 1% бисульфитом натрия 1 мин. и промыва- ют в проточной воде 2 мин.;

  4. инкубируют мазки 4 ч. при 47 в растворе: вода – 50 мл, бура 5% - 3 мл, основной раствор – 50 мл (основной раствор: уро- тропин 3% - 100 мл, AgNО3 5% - 5 мл), выдерживают при ком- натной температуре 48 часов, затем хранят в холодильнике;

  5. промывают в двух сменах воды и помещают в 0,2% рас- твор хлористого золота на 5 мин.;

  6. обрабатывают мазки в двух сменах 2% гипосульфита натрия;

  7. промывают водой;

  8. докрашивают ядра в 1% сафранине 2 мин.;

  9. промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. Результат: полисахариды окрашиваются в черный цвет, ядра

  • в красный.



        1. Выявление кислых мукополисахаридов по методу Гале (Хейла)


Пригодны свежезамороженные и полученные после фик- сации формалином, в жидкости Карнуа и парафиновые срезы. Метод основан на свойстве мукополисахаридов абсорбировать коллоидный гидроксид железа, который затем выявляют воз- действием на срез раствором желтой кровяной соли. Это при- водит к образованию берлинской лазури.

Приготовление рабочего раствора. В 100 мл дважды дис- тиллированной кипящей воды вливают каплями при помеши- вании 8-12 мл 10% раствора хлорного железа. Цвет раствора меняется от коричневого до темно-красного. Раствор охлажда-

ют и с помощью диализа из него удаляют НСl. Для этого можно использовать мешочек из целлофана. В диализованный гидро- ксид железа добавляют 2М уксусную кислоту в соотношении от 1:1 до 3:1. Полученный реактив Хейла пригоден для исполь- зования через сутки. В холодильнике можно хранить несколько месяцев.

Методика. Депарафинированные, доведенные до воды срезы помещают в реактив Хейла на 20-30 мин. при комнатной температуре (реактив можно накапать на срезы в чашках Пет- ри), затем промывают в трех сменах 2М уксусной кислоты по 2- 3 мин. в каждой, обрабатывают 0,5-1 % раствором желтой кро- вяной соли на 1% НС1 в течение 15 мин., промывают водой, обезвоживают спиртами, заключают в бальзам. Результат: кис- лые мукополисахариды окрашены в синий цвет. Срез можно докрасить нейтральным красным, эозином, кислым фуксином.

        1. Выявление мукополисахаридов толуидиновым


синим

О наличии тех или иных мукополисахаридов в соедини- тельной ткани при окрашивании толуидиновым синим свиде- тельствует появление метахромазии. Метахромазия – это такая окраска, когда в результате химической реакции между тканью и красителем цвет структур отличается от исходного красителя. Так, толуидиновый синий, азур, тионин и другие окрашивают субстрат, с которым реагируют, не в синий, а в цвета от фиолето- вого до розового. Считается, что при рН 4,0 и ниже метахрома- зию могут давать только кислые мукополисахариды, при рН вы- ше 4,0 – муко- и гликопротеины.



Методика 1. Доведенные до воды срезы на 5-15 мин. поме- щают в рабочий раствор (смесь равных частей насыщенного рас- твора толуидинового синего в 96% спирте), ополаскивают в воде и на 20-60 мин. помещают в профильтрованный 5-10% раствор молибденово-кислого аммония, промывают, обезвоживают, про- светляют и, минуя карбол-ксилол, заключают в бальзам. Резуль- тат: мукополисахариды окрашиваются в цвета от фиолетового до вишнево-красного.

Методика 2. Свежезамороженные, фиксированные форма- лином срезы окрашивают в 0,5% водном растворе толуидинового

синего в течение 4-6 ч., ополаскивают в дистиллированной воде и сразу исследуют под микроскопом. Результат: метахроматиче- ские вещества красные, розовые (v-метахромазия) или пурпурные (b-метахромазия).

Дифференцировка кислых мукополисахаридов. Кислые муко- полисахариды окрашиваются альциановым синим, коллоидным же- лезом, дают метахроматическую окраску, но не дают положитель- ной ШИК-реакции. Их разделяют на несульфатированные (гиалуро- новая кислота, хондроитин) и сульфатированные (хондроитинсуль- фаты А, В, С, кератинсульфат, гепарин-сульфат, гепарин).

      1. Окраска по Галле-Мюллер+ШИК-реакция


    1. Приготовить 200 мл физраствора (по 2 баночки): 2 г хло- ристого натрия на 200 мл дистил. воды.

    2. 100 мл тестикулярной гиалуронидазы (на 100 мл – 100 мг гиалуронидазы).

    3. Срезы, фильтрованные в формолацетате довести до воды через ксилолы, спирты.

    4. Контрольные срезы инкубировать в физрастворе 3 ч. при температуре 37С.

    5. Опытные срезы инкубируют в физрастворе 3 ч. при тем- пературе 37С.

    6. Вода дистиллированная.

    7. Провести процедуры по Мюллеру:

депарафинированные срезы поместить в рабочий раствор на

10-15 мин.

Приготовление рабочего раствора: прилить по капле 12 мл 32% раствора хлорного железа к 750 мл кипящей дистиллированной воды. Приготовить раствор: 1,2 мл CH3COOH в 10 мл воды. Сме- шать раствор хлорного железа и раствор CH3COOH в соотношении 10:1 (непосредственно перед использованием, рН – не более 2).


    1. Промывка в дистиллированной воде по 1 мин. 5 раз.

    2. Споласкивание срезов в 2 М растворе CH3COOH (на 1 литр

120 мл CH3COOH) дважды.

    1. Поместить на 10 мин. в 1% раствор желтой кровяной со-

ли (1 г соли на 100 мл 1% HCl – (1 мл HCl на 100 мл воды)).

    1. Тщательно промыть в двух сменах дистиллированной воды.



    1. Промывка водопроводной водой.

    2. Провести процедуры по ШИК:

  • вода дистиллированная;

  • перйодат натрия……..15 мин.;

  • вода водопроводная….5 мин. дважды;

  • вода дистиллированная;

  • реактив ШИФ………...40 мин.;

  • сернистая вода………..по 2 мин. 3 раза

  • вода водопроводная…10 мин.;

  • вода дистиллированная;

  • гематоксилин………10-15 мин.;

  • вода водопроводная…10 мин.;

  • вода дистиллированная;

  • спирты, ксилолы;

  • заключение в бальзам.



      1. Поделитесь с Вашими друзьями:
1   ...   12   13   14   15   16   17   18   19   ...   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница