Морфологические методы doc



страница2/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   30

ВВЕДЕНИЕ

В учебном пособии предложен материал для более полного освоения студентами дисциплин «Цитология, гистология, эм- бриология», «Патологическая анатомия и судебно-ветеринарная экспертиза» по специальности 36.05.01 «Ветеринария»; направ- лениям 36.03.01 «Ветеринарно-санитарная экспертиза», «Морфо- логия животных» - 36.03.02 «Зоотехния».

Материал учебного пособия позволит студентам углубить знания в области различных методов исследований живых клеток и тканей, исследований химического состава и метаболизма кле- ток тканей, методов анализа изображений клеточных и тканевых структур, более глубоко изучить гистологическую технику, осво- ить специальные гистохимические методы окраски, позволяющие выявить содержание различных по химическому составу веществ в органах и тканях, более детально изучить структуры органов и систем организма, освоить электронную микроскопию, а полу- ченные знания применять для изучения клинических дисциплин в дальнейшей практической деятельности.


  1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В МОРФОЛОГИИ


В современной морфологии применяются разнообразные ме- тоды исследования, позволяющие всесторонне изучать процессы развития, строение и функции клеток, тканей и органов в норме и при патологии.

Главными этапами цитологического и гистологического ана- лизов являются выбор: объекта исследования, подготовка его для изучения, микроскопирование, качественный и количественный анализ изображений.



Объектами исследования служат живые и мертвые (фиксиро- ванные) клетки и ткани in vivo, их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах или на телевизионном эк- ране дисплея. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных выше объектов.


  1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Изучение живых клеток и тканей позволяет получить наибо- лее полную информацию об их жизнедеятельности – проследить движение, процессы деления, разрушения, роста, дифференци- ровки и взаимодействия клеток, определять продолжительность их жизненного цикла, исследовать реактивные изменения в ответ на воздействие различных факторов.

Прижизненные (in vivo) исследования клеток в организме

Одним из прижизненных методов исследования клеток явля- ется оценка их структур с помощью специальных просвечиваю- щих микроскопов-иллюминаторов. Так можно изучать в динами- ке циркуляцию крови в микрососудах. После проведения анесте- зии у животного объект исследования (например, брыжейку ки- шечника) выводят наружу и микроскопируют, при этом ткани постоянно увлажняют физиологическим раствором. Однако дли- тельность такого наблюдения ограничена. Лучший результат дает метод вживления прозрачных камер в организм животного. Наи- более удобным органом для вживления таких камер и последую- щего наблюдения является ухо животного (например, кролика). Участок уха с прозрачной камерой помещают на предметный столик микроскопа и в этих условиях изучают динамику измене- ния клеток и тканей в течение продолжительного времени.



Витальное и суправитальное. При витальном (прижизнен- ном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм животного, при этом он избирательно окрашивает клетки, их ор- ганеллы или межклеточное вещество. Например, трипановый си- ний или литиевый кармин выявляют фагоциты, ализарин – ново- образованный матрикс кости.

Суправитальным называют окрашивание живых клеток, вы- деленных из организма. Таким способом выявляют молодые формы эритроцитов – ретикулоциты крови (краситель бриллиан- товый крезиловый голубой), митохондрии в клетках (краситель зеленый янус), лизосомы (краситель нейтральный красный).

  1. ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА ПОСЛЕ ФИКСАЦИИ


Исследованию подвергаются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных структур.

Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, спинномозговой жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из тка- ни (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез. Наиболее часто для изучения используют срез ткани или органа.

Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа можно сразу микроскопировать. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они пло- хо выявляются в обычном световом микроскопе, и требуется ис- пользование специальных микроскопов (фазово-контрастных и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препа- раты: фиксированные, заключенные в твердую среду и окрашен- ные.

Процесс изготовления гистологического препарата для све- товой и электронной микроскопии включает следующие основ- ные этапы:



    1. взятие материала и его фиксация;

    2. уплотнение материала;

    3. приготовление срезов;

    4. окрашивание срезов.

Для световой микроскопии необходим еще один этап – за- ключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды.



Взятие и фиксация материала. Фиксация обеспечивает предотвращение процессов аутолиза, что способствует сохране- нию целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевую кислоту, специаль- ные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обра- ботке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существен- ным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а струк- туры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приво- дит к уплотнению и уменьшению объема образцов, а также к улучшению восприятия красителей.

Общие принципы фиксации


  1. После вырезки образца ткани его немедленно погружают в фиксатор, объем которого должен в 10-20 раз превышать объем фиксируемого материала.

  2. После погружения образца в фиксатор недопустимо изме- нение цвета фиксирующей жидкости, в противном случае фикса- тор немедленно меняется.

  3. Повторное использование фиксатора недопустимо.

  4. Необходимо строго соблюдать установленное время фик- сации для каждой фиксирующей жидкости.

Широко используемым фиксатором является формалин, представляющий собой 40% раствор формальдегида. Из него го- товят нейтральный (забуференный до Рн 7,0) 10-12% раствор формалина.

Обезвоживание и заливка материала. После формалиновой фиксации образцы промывают в течение 6, 12 или 24 часов в про- точной воде. Перед заливкой материала в парафин или целлоидин его обезвоживают. Традиционный способ обезвоживания – про- водка по спиртам восходящих концентраций, начиная с 70%.

Уплотнение образцов, необходимое для приготовления сре- зов, производят путем пропитывания предварительно обезвожен- ного материала парафином, целлоидином, органическими смола-

ми. Более быстрого уплотнения достигают применением метода замораживания образцов, например, в жидкой углекислоте.



Приготовление срезов для световой микроскопии осущест- вляют на специальных приборах – микротомах.

Окрашивание срезов применяют для увеличения контраст- ности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследова- ния. Гистологические красители подразделяют на кислые, ос- новные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель азур II, который окрашива- ет ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель – эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избиратель- ное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются ок- сифильными, основными – базофильными. Структуры, воспри- нимающие как кислые, так и основные красители, являются ней- трофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обыч- но обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просвет- ляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез за- ключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для микроскопирования в течение мно- гих лет. Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрасти- руют солями марганца, кобальта и др., после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препара- тами.




Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница