Морфологические методы doc


ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ



страница3/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   30

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И МЕТАБОЛИЗМА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ



Цито- и гистохимические методы. Эти методы позволяют выявлять локализацию различных химических веществ в струк- турах клеток, тканей и органов – ДНК, РНК, белков, углеводов,

липидов, аминокислот, минеральных веществ, витаминов, актив- ность ферментов. Они основаны на специфичности реакции меж- ду химическим реактивом и субстратом, входящим в состав кле- точных и тканевых структур, и на окрашивании продуктов хими- ческих реакций. Для повышения специфичности реакции часто применяют ферментативный контроль. Например, для выявления в клетках рибонуклеиновой кислоты (РНК) часто используют галлоцианин – краситель с основными свойствами, а наличие РНК подтверждают контрольной обработкой рибонуклеазой, расщепляющей РНК. Галлоцианин окрашивает РНК в сине- фиолетовый цвет. Если срез предварительно обработать рибо- нуклеазой, а затем окрасить галлоцианином, то отсутствие окра- шивания подтверждает наличие в структуре рибонуклеиновой кислоты. Описание многочисленных цито- и гистохимических методов дается в специальных руководствах.



Методы иммунофлюоресцентного анализа. Данные мето- ды эффективно используются в современной гистологии. Они применяются для изучения процессов дифференцировки клеток, выявления в них специфических химических соединений и структур, основаны на реакциях антиген-антитело. Каждая клетка организма имеет специфический антигенный состав, который, главным образом, определяется белками. Продукты реакции можно окрашивать и выявлять люминесцентным микроскопиро- ванием.

Вопросы для самоконтроля



  1. Назовите методы исследования живых клеток и тканей.

  2. Перечислите, что является объектом исследований в мор- фологии.

  3. С помощью каких методов можно определить химиче- ский состав и метаболизм клеток и тканей?

  4. Что является объектом при исследовании мертвых (фик-

сированных) клеток и тканей?

  1. Назовите фиксаторы, применяемые для сохранения цело- стности структур.


    1. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ



Световая микроскопия. Микроскопирование – основной метод изучения препаратов. Для изучения гистологических пре- паратов чаще применяют обычные световые микроскопы различ- ных марок, когда в качестве источника освещения используют естественный или искусственный свет.

Ультрафиолетовая микроскопия. Это разновидность све- товой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе использу- ют более короткие ультрафиолетовые лучи длиной волны около 0,2 мкм.

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явле- ния флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в воз- бужденное состояние. Обратный переход из возбужденного со- стояния в нормальное происходит с испусканием света, но с дру- гой, большей длиной волны. В флуоресцентном микроскопе в ка- честве источников света для возбуждения флюоресценции при- меняют ртутные или ксеноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине- фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделя- ют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюорес- ценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой. Вторич- ная флюоресценция возникает при обработке препаратов специ- альными красителями – флюорохромами. Например, при обра- ботке препаратов чаще всего употребляется флюорохром акри- диновый оранжевый. В этом случае ДНК и ее соединения в клет- ках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные – ярко-красное свечение. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта, его химическом составе. Вариант метода флуоресцентной микроскопии, при ко- тором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в

ультрафиолетовой области спектра, получил название метода


ультрафиолетовой флуоресцентной микроскопии.


Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для изучения препаратов в обычном световом микроскопе необ- ходимая контрастность структур достигается с помощью окра- шивания. Метод фазового контраста обеспечивает требуемую контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специ- альной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовы- вать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света и фиксировать изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения. Повыше- ние контраста позволяет видеть все структуры, различающиеся по показателю преломления. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым кон- трастом изображение.

Кроме перечисленных методов, для специальных целей при- меняются: микроскопия в темном поле при изучении живых объ- ектов, в падающем свете – для рассмотрения толстых объектов, поляризационная микроскопия для изучения архитектоники гис- тологических структур, способных к инвертированию светового потока (липиды). Описание этих методов и соответствующих приборов приводится в специальных руководствах.



    1. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ СТРУКТУР


Полученные изображения микрообъектов в микроскопе, на телевизионном экране дисплея, на электронных микрофотогра- фиях могут подвергаться специальному анализу – выявлению морфометрических, денситометрических параметров и их стати- стической обработке.

Морфометрические методы позволяют определять с помо- щью специальных сеток (Г.Г. Автандилов, Е. Вейбеля, А.А. Гла- голева, С.Б. Стефанова) число любых структур, их площади, диа-

метры и др. В частности, в клетках могут быть измерены площа- ди ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазматические отношения и др. Существует ручная морфометрия и автоматизи- рованная морфометрия, при которой все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически.

В последние годы все большее распространение получают автоматизированные системы обработки изображений, позво- ляющие наиболее эффективно реализовать перечисленные выше количественные методы для изучения клеток и тканей. При этом аналитические возможности количественной микроскопии до- полняются методами анализа и распознавания образов, основан- ными на обработке с помощью компьютера информации, извле- каемой из изображений клеток и тканей.

Вместе с тем участие в эксперименте компьютерной техники требует от исследователя нового подхода к его проведению, вла- дения навыками составления алгоритмов процесса исследования, точности рассуждений и, в конечном итоге, повышения научно- методологического уровня исследования.

Одним из методов, существенно расширивших число решае- мых морфологических задач, является оптико-структурный ма- шинный анализ.

Система предназначена для проведения комплексных иссле- дований клеток и тканей с использованием методов абсорбцион- ной, флуоресцентной микроскопии и радиоавтографии.

Входящий в состав системы специальный сканирующий оп- тический или электронный микроскоп осуществляет последова- тельный просмотр изображения препарата, преобразуя его в циф- ровую форму, и вводит в память компьютера, который, в свою очередь, производит цифровую обработку изображения и выдает информацию о геометрических и других характеристиках анали- зируемого объекта. С помощью цветного дисплея исследователь может «препарировать» изображения, выделяя лишь те структур- ные составляющие, которые его интересуют. Входящие в состав компьютера накопители информации позволяют запоминать как сами изображения, так и результаты их обработки для после- дующего хранения и документирования.

Вопросы для самоконтроля



      1. Назовите методы микроскопирования гистологических препаратов.

      2. В чем заключается суть явления флюоресценции?

      3. Для чего служит метод фазово-контрастной микроско-

пии?

      1. Назовите методы анализа изображения клеточных и тка-

невых структур.

      1. Какой из методов анализа изображения клеточных и тка- невых структур чаще всего применяется в настоящее время?



Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница