Морфологические методы doc


Проведение образцов через смолы



страница30/30
Дата14.03.2019
Размер4.42 Mb.
#75249
1   ...   22   23   24   25   26   27   28   29   30

Проведение образцов через смолы


  1. Смола : Ацетон № 2 = 1:1.

При помощи отломанной пастеровской пипетки 1/3 часть из содержимого бюксика переносится в чистый пенициллиновый флакон. Слой смолы в пенициллиновом флаконе заливают таким же слоем ацетона. Пастеровскую пипетку, которой брали смолу, тщательно промывают в слое ацетона над смолой во флаконе. Потом флакон закрывают пробкой, содержимое тщательно взбал- тывают. После этого полученную смесь (1 часть смолы – 1 часть ацетона № 2) распределяют по флаконам с образцами (см. фикса- цию материала) и оставляют их открытыми на 2 ч. чтобы испа- рялся ацетон.

  1. Смола : Ацетон № 2 = 3:1.

В пенициллиновый флакон переносится ½ часть из содержи- мого бюксика, т.е. смолы. Исходя из толщины слоя смолы в пе- нициллиновые флаконы добавляется ацетон из расчета 3 части смолы на 1 часть ацетона. После взбалтывания полученную смесь (3 часть смолы – 1 часть ацетона № 2) распределяют по флаконам с образцами и оставляют их открытыми на 2 ч. чтобы испарялся ацетон. По истечении 2 ч. добавляют по каплям смолу и оставля- ют на ночь. Одновременно готовят пластинки и переносят в тер- мостат при температуре 37С или 1 ч. при 60С.

    1. Порядок фиксации материала по дням Первый день фиксации материала


    1. Глютаровый фиксатор…..во время взятия материала и в течение 2 ч. при температуре 0С или в холодильнике, через 2 ч. слить.

    2. Буфер с сахарозой…15 мин. под тягой, вертушка, слить.

    3. Буфер с сахарозой…15 мин. под тягой, вертушка, слить.

    4. Осмий для постфиксации…30 мин. в холодильнике и 30 мин.

при комнатной температуре слить или 1 час вертушка.

5.S-коллидиновый буфер…..15 мин. при комнатной темпе- ратуре, вертушка, слить.

6. 50% ацетон………………..15 мин. также.

7. 60% ацетон………………..15 мин. также.

8. 70% ацетон………………..15 мин. также.


  1. 0,5% раствор уранилацетата на 70% ацетоне…………….на ночь при комнатной температуре.

Примечание: после истечения указанного срока фиксации для указанного фиксатора внимательно слить фиксатор в стакан, не допуская при этом попадания в него материала. После удале- ния фиксатора флакон переворачивают вверх дном на листок фильтровальной бумаги с целью удаления всего фиксатора. При удалении ацетона флаконы не переворачивают на бумагу, а сли- вают ацетон, чтобы не происходило подсыхания. Работу прово- дить в вытяжном шкафу. Флаконы закрывать пробками. Разведе- ние ацетона производить за 10-15 мин. до применения. Тщатель- но встряхивать.

Второй день фиксации материала


    1. Приготовить смолу для фиксации.

а) Фиксация в 80% ацетоне……25 мин. при комнатной тем- пературе на простой мешалке, флакон закрывать;

б) 90% ацетон………………………………15 мин. также. в) Ацетон № 1, № 1, № 2……………………30 мин. также.



    1. Приготовить пластинку и положить в термостат при тем- пературе 37С (можно на сутки).

    2. Смесь – 1 часть смолы + 1 часть ацетона № 2……2 ч. флакон держать открытым.

    3. Приготовить смолу для фиксации материала на ночь.

    4. Смесь – 3 части смолы + 1 часть ацетона № 2 - 2 ч. фла- кон держать открытым (примечание: предыдущую смолу из фла- кона удаляют при помощи пастеровской пипетки).

    5. Не удаляя предыдущую смолу, добавляют чистую смолу на ночь при комнатной температуре, флакон держать открытым.

    6. Приготовление смолы и смеси смолы с ацетоном см. в описании. Посуду после удаления смолы промывать в ацетоне. Ацетон после указанного срока фиксации не удаляют из всех флаконов одновременно и не переворачивают флаконы на фильт- ровальную бумагу, чтобы не происходило подсыхания материала.


Третий день фиксации материала


  1. Вынуть пластинку из термостата и положить остужать при комнатной температуре под стеклянным колпаком.

  2. Приготовить смолу (эпоны + катализатор = 15 мл 3 или 10 мл). В зависимости от качества катализатора последний до- бавляют в количестве 0,3-0,37 мл (чаще 0,3 мл).

  3. Приготовить фильтровальную бумагу для высушивания образцов (распределять на сегменты при помощи простого ка- рандаша и написать номера образцов).

  4. Из флаконов образцы при помощи иглы для препариро- вания или хирургического пинцета перенести на фильтровальную бумагу, предварительно погружая их в смолу, по 5 кусочков ма- териала из каждого образца. Кусочки должны соответствовать размеру 1 мм3.

  5. После перенесения кусочков материала из всех образцов, внимательно передвигать кусочки иглой на сухой участок фильт- ровальной бумаги для высушивания в течение 2-3 ч. При более продолжительном высушивании материал испортится.

  6. При помощи пастеровской пипетки заливают смолу в ячейки пластинки до образования выпуклой формы.

  7. Препаровальной иглой, предварительно поместив ее в смолу, перенести кусочки материала в смолу в центральной части ячейки. Следить, чтобы кусочки материала во время оседания на дно, оставались в центральной части ячейки.

  8. Поставить пластинку с образцами на ночь в термостат при температуре 37С.



Четвертый день фиксации материала


Переключить температуру в термостате на 60С. Пластинку оставить при данной температуре на ночь (18-24 ч.).

Пятый день фиксации материала


  1. Вынуть пластинку из термостата и оставить при комнат- ной температуре под стеклянным колпаком в течение ч. При бо- лее продолжительном охлаждении пластинки блоки трудно под- даются выбиванию. Блоки можно выбивать сразу после взятия пластинки из термостата.



  1. Снять пленку и лейкопластырь с номерами.

  2. Пластинку положить на 2 подставки, между которыми оставляют пространство. При помощи выбивалки, диаметр кото- рой 4 мм, со стороны материала резким движением и ударом ру- кой по держателю выбивалки выбивают блоки.

  3. Одновременно проверяя номера на блоках, блоки склады- вают в бумажные пакеты. В каждом пакете складывают блоки из одного образца (т. е. 5 блоков). На пакетах пишут № образца.



    1. Приготовление матрицы для бескапсульной заливки блоков


Используют пластинки из фторопласта произвольных разме- ров. Высверливается большое количество отверстий диаметром 5 мм. При повторном применении поверхность пластинки проти- рают наждачной бумагой и ацетоном с целью удаления остатков смолы. Через ячейки проводят марлю, смоченную ацетоном. На очищенную пластинку накладывают липкую ленту (лента склеи- вающая ЛТ-40-19. Ширина – 19 мм. МРТУ-6-17-276-68), чтобы ее концы можно было загибать за края пластинки. Во время нанесе- ния ленты ее необходимо сильно натягивать. Далее ленту плотно притирают к поверхности пластинки, особенно внимательно нужно притереть крайние ряды. Ленту наклеивают в двух взаим- но перпендикулярных направлениях.

На боковую поверхность пластинки наклеить полосу лейко- пластыря, на которой выписывают номера образцов.

В образовавшиеся ячейки закладывают папиросную бумагу с напечатанными номерами образцов. Номера, написанные на лейко- пластыре и бумаге, должны соответствовать. Для каждого образца материала используется 5 ячеек. Вырезанные номера закладываются в ячейки хирургическим пинцетом, осторожно, чтобы не повредить им ленту, покрывающую дно пластинки. Номера закладываются на- печатанной стороной наружу, т.е. к стенке ячейки.

Пластинка приготавливается на второй день фиксации мате- риала. Таким образом приготовленная пластинка ставится в тер- мостат для подсушивания при температуре 37С на 18-24 ч. (до заливания блоков). При необходимости пластинку можно подсу- шить при 60С в термостате в течение 1 ч. (но нежелательно).




    1. Изготовление мерных бюксов для приготовления смолы


Состав смолы

Количество смолы

15 мл

10 мл

Эпон 812

6,75 мл

4,5 мл

Эпон DDSA

4,5 мл

3,0 мл

Эпон MNA

3,0 мл

2,0 мл

Эпон DMP

0,37 мл

0,25 мл

Бюкс графируется для Эпонов 812, DDSA. С одной стороны бюкс графируют для количества 10 мл, с другой стороны – для 15 мл. В бюкс наливают 4,5 мл воды, ставят на подставку и при помощи стеклореза делают нарез на наружной стороне. После получения нареза в бюксик наливают еще 3 мл и делают сле- дующий нарез. Потом 2,0 мл воды, и так до 10 мл.

    1. Окрашивание сеток с материалом


      1. Приготовление реактивов

  1. 4% уранилацетат - 400 мг уранилацетат + 10 мл биди- стиллированной воды и тщательно встряхивать в течение 30 мин. Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике неогра- ниченное время. Уранилацетат трудно растворяется в воде и дает небольшой осадок. Перед употреблением нужное количество следует профильтровать через бумажный фильтр. Неиспользо- ванный фильтрат вылить обратно во флакон для хранения.

  2. 1н NaOH: 4 г едкого натра довести до 100 мл бидистил- лированной водой

0,01 н NaOH: 1 мл 1 н NaOH + 99 мл бидистиллированной воды 0,02 н NaOH: 1 мл 1 н NaOH + 49 мл бидистиллированной воды.

  1. Цитрат свинца (материнский раствор). Для приготовления свинца свинец азотнокислый Pb(NO3)2 в количестве 1,33 г и на- трий лимоннокислый Na(C6H3O7)H2O в количестве 1,76 г (если трехзамещенный с содержанием воды 5,5 мл – 2,8 г) смешивают и тщательно встряхивают в течение 30 мин. с 30 мл бидистиллиро- ванной воды в колбочке. Данная смесь окрашивается в молочно- белый цвет, непрозрачная, густой консистенции. После взбалтыва- ния в течение 30 мин., туда добавляется 8 мл 1н NaOH, раствор сразу должен стать прозрачным. Далее доливают до 50 мл отметки бидистиллированную воду. Приготовленный цитрат свинца (рН=12) хранится в холодильнике 6 месяцев. Если во время хране-

ния выпадает осадок, то данный раствор применять нельзя и надо приготовить новый. Выпадение свинца связано с неаккуратным приготовлением и применением грязной посуды. Поэтому посуда должна быть чистой (хромпик 2-3 дня, проточная, дистиллирован- ная, бидистиллированная вода, высушить в сушильном шкафу при температуре 120С. Перед обработкой в хромпике посуду промыть в мыльном порошке и прополоскать в воде).



  1. Цитрат свинца для окрашивания материала: 1 мл мате- ринского цитрата свинца + 5 мл 0,01 н NaOH. Готовить в вытяж- ном шкафу, посуда должна быть чистой. Цитрат свинца для ок- рашивания материала готовить за 10 мин. до окрашивания.
      1. Окрашивание сеток


  1. Два парафиновых бюкса почистить шпателем. При помо- щи шпателя легким движением снять верхний слой парафина внутри луночки. В результате этого внутренний слой луночки на- чинает блестеть. После чистки луночек бюкса шпателем, в боко- вые углубления бюкса наливают бидистиллированную воду до образования выпуклой поверхности. Чашку с парафиновым бюк- сом нужно поворачивать, чтобы треугольная выемка, вырезанная в парафиновом бюксе, находилась вверху. При помощи пинцета из бюкса №… берется сетка и кладется в луночки. Закладку сеток начинают с верхней левой стороны парафинового бюкса. Срезы образцов нанесены на 5 сеток. Для окрашивания обычно из них используют 2 сетки под номером 1 и 5 (при резке блоков лучшие срезы наносятся на сетки, которые кладутся в углубления бюкса под номером 1 и 5). Одновременно на листочки, находящиеся в крышечке бюкса, на которой написаны номера образцов и номера сеток, подчеркиваются номера окрашенных сеток.

После нанесения сеток во всех луночках парафинового бюкса чашка закрывается крышкой. Крышку круговым движением слегка притереть к парафиновому бюксу. Свободное пространст- во между крышкой и чашкой при помощи пипетки заполнить би- дистиллированной водой для создания герметичности. Следить, чтобы во время заполнения пространства вода не попала внутрь чашки, что можно наблюдать при недостаточном притирании крышки к блоку парафина. Далее чашка ставится на 1,5 ч. в тер- мостит при температуре 37С.

Приготавливают 1н NaOH, 0,01н NaOH, 0,02 NaOH. За 10-15 мин. до окончания окраски уранилацетатом готовят цитрат свинца для окрашивания сеток, т.е. материала. Берут 1 мл цитрата свинца материнского + 5 мл 0,01н NaOH. Далее берут вторую чашку с па- рафином для окрашивания материала (луночки должны быть зара- нее почищены), и в боковые отверстия бюкса вносится таблетка ед- кого натра. В луночки бюкса чистой глазной пипеткой наливают приготовленный цитрат свинца. Луночки наполняют цитратом свинца до выпуклой формы. Заполнение луночек начинается в верх- нем левом углу. Крышка чашечки должна быть только приоткрыта, стараться не дышать. Крышку приоткрывать от себя, т. е. заполнять луночки, находящиеся далее от себя.

Чашку с парафиновым бюксом поворачивают, чтобы треуголь- ная выемка, вырезанная в парафиновом бюксе, находилась вверху.

Приготовить 3 стаканчика со свежеприготовленной бидистил- лированной водой.

Через 1,5 ч. с момента нанесения сеток с материалом в ура- нилацетате парафиновый бюкс с окрашенными сетками вынима- ют из термостата. Далее, начиная с верхнего левого угла, при по- мощи пинцета вынимают одну сеточку и промывают ее в трех стаканчиках с бидистиллированной водой по 30 раз в каждом стаканчике. Промывание проводить быстрыми движениями.

После промывания во всех трех стаканчиках сеточку легко встряхивают и помещают в парафиновую чашку № 2 с цитратом свинца. Крышку чашечки приоткрывают от себя.

После перемещения всех сеток, крышку чашки круговым движением слегка притирают к парафиновому бюксу. Свободное пространство между крышкой и чашкой заполняют бидистилли- рованной водой. Потом закрытую чашку покрывают чашечкой черного цвета и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч.

Через 0,5 ч. после нанесения сеток с материалом в цитрате свинца вынимают по одной сетке, начиная с верхнего левого угла, и промывают ее в 0,02н NaOH – 60 раз; в бидистиллированной воде – 60 раз; в бидистиллированной воде – 60 раз. Промывать быстро, резким движением перемещая сетку по направлению вверх, вниз в жидкости, считая, сколько раз погружается сетка в жидкость.

После промывания сетку бросают на фильтровальную бума- гу, после чего ее помещают в бюксе ячейки, откуда сетка выни-

малась для окрашивания. Парафиновые чашки № 1 и № 2 промы- вают под струей воды и переворачивают вверх дном на фильтро- вальную бумагу для высушивания. Всю посуду после примене- ния цитрата свинца промывают в 1н NaOH, затем как обычно.


      1. Окрашивание сеток с материалом


(порядок окраски)

    1. Парафиновые бюксы почистить шпателем (снять тонкий слой).

    2. В парафиновый бюкс № 1 (для уранилацетата) накапать бидистиллированную воду в боковые углубления.

    3. Профильтровать 4% уранилацетат (небольшое количест- во) и накапать глазной пипеткой в луночки.

    4. Чашку с парафиновым бюксом поворачивают, чтобы треугольная выемка, вырезанная в парафине, находилась вверху

    5. В луночки положить сеточки в определенном порядке

(см. описание).

    1. Отмечать на листочке находящиеся в крышечке бюкса срезы, номера ячеек, из которых брались срезы для окраски.

    2. Крышку круговым движением слегка притереть к пара- финовому бюксу.

    3. Свободное пространство между крышкой и чашкой за- полняют бидистиллированной водой.

    4. Чашку с сетками поместить в термостат при температуре

37С на 1,5 ч.

    1. Приготовить сразу после помещения чашки в термостат

1н NaOH, 0,01н NaOH и 0,02 NaOH.

    1. За 10-15 мин. до окончания окраски уранилацетатом готовят цитрат свинца для окрашивания материала (1 мл мате- ринского цитрата свинца + 5 мл 0,01 н NaOH).

    2. В углубления пристеночного бюкса № 2 внести таблет- ки едкого натра.

    3. В луночках бюкса № 2 наливают приготовленный цит- рат свинца для окрашивания материала. Во время нанесения ста- раться не дышать.

    4. Приготовить 3 стаканчика со свежеприготовленной би- дистиллированной водой.



    1. Вынуть бюкс № 1 из термостата (через 1,5 ч. после на- несения в него материала).

    2. Вынимать по одной сетке из бюкса № 1. Каждую сетку погружать в стаканчики с бидистиллированной водой – по 60 раз.

    3. После промывания сетки во всех трех стаканчиках се- точку легко встряхивают или просушивают, прикладывая к фильтровальной бумаге, и помещают в парафиновую чашку (бюкс) с цитратом свинца.

    4. После перемещения всех сеток бюкс закрывают крыш- кой, которую слегка притирают к парафиновому бюксу.

    5. Пространство между крышкой и чашкой заполняют би- дистиллированной водой.

    6. Закрытую чашку накрывают чашкой из черного цвета и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч.

    7. Приготовить 3 стаканчика для промывания сеток: в стаканчик №1 налить 0,02н NaOH, в стаканчик № 2 – бидистил- лированную воду, в стаканчик №3 – бидистиллированную воду.

    8. Через 30 мин. после нанесения сеток в цитрате свинца, вынимают по одной сетке из бюкса № 2. После сетку быстрым движением помещают в стаканчик № 1. Стараться в это время не дышать. В каждом стаканчике промывать по 60 раз.

    9. После промывания сетку бросают на фильтровальную бумагу и сразу после этого помещают в бюкс ячейки, откуда сет- ка вынималась для окрашивания (т.е. бокс для хранения сеток). Парафиновые чашки № 1 и № 2 промывают под струей воды и переворачивают вверх дном для высушивания. Всю посуду после применения цитрата свинца промывают в 1н NaOH.

Вопросы для самоконтроля



  1. Как производится отбор проб для электронной микро- скопии?

  2. С помощью каких реактивов фиксируют материал?

  3. Опишите окрашивание сеток с материалом.

  4. Назовите преимущества электронной микроскопии перед световой.


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


  1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Ав- тандилов. – Москва : Медицина, 1990. – 384 с.

  2. Авцын А. П. Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии / А. П. Авцын, А. И. Струков, Б. Б. Фукс. – Ленинград : Медицина, 1971. – 368 с.

  3. Артишевский А.А. Гистология с техникой гистологических исследований : учебное пособие / А.А. Артишевский, А.С. Леонтюк, Б.А. Слука. – Минск : Высшая школа, 1999. – 226 с.

  4. Гайер Г. Электронная микроскопия / Г. Гайер. – Москва :

Мир, 1974. – 487 с.

  1. Гольдин Л. С. Основы гистологической техники элек- тронной микроскопии / Л. С. Гольдин. – Москва : Государствен- ное издательство медицинской литературы, 1963. – 257 с.

  2. Елисеев В. Г. Основы общей гистологии и гистологиче- ская техника / В. Г. Елисеев. – Москва : Медгиз, 1999. – 214 с.

  3. Жаров А.В. Патологическая анатомия животных : учеб- ник / А.В. Жаров. – Москва : Лань, 2013. – 608 с.

  4. Жаров А.В. Судебная ветеринарная медицина : учебник /

А.В. Жаров. – Москва : Лань, 2014. – 464 с.

  1. Кононский А. И. Гистохимия / А. И. Кононский. – Мо- сква : Наука, 1976. – 280 с.

  2. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли. – Москва : Мир, 1969. – 639 с.

  3. Лойда З. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы

/ З. Лойда, Р. Гроссау, Т. Шиблер. – Москва : Мир, 1982. – 272 с.

  1. Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники

/ Г. А. Меркулов. – Москва : Медицина, 1969. – 424 с.

  1. Микроскопическая техника : руководство / под редак- цией Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова – Москва : Медицина, 1996.

– 463 с.

  1. Методы морфологических исследований : методическое пособие / С.М. Сулейманов [и др.]. – Воронеж : ВГАУ, 2012. – 103 с.

  2. Патоморфологическая диагностика болезней животных :

атлас-альбом: учебное пособие / под ред. Б.Л. Белкина, А.В. Жарова.

  • Москва : Аквариум, 2013 . – 231 с.



  1. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс.

  • Москва : Издательство иностранной литературы, 1962. – 962 с.

  1. Поликар А. Субмикроскопические структуры клеток и тка- ней в норме и патологии / А. Поликар, Ш. А. Бо. – Ленинград : Лен- медгиз, 1962. – 468 с.

  2. Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. – Моск- ва : Издательство иностранной литературы, 1954. – 719 с.

  3. Салимов В. А. Практикум по патологической анатомии животных / В. А. Салимов. – Москва : Лань, 2013. – 352 с.

  4. Соколов В.И. Цитология, гистология, эмбриология : учеб- ник /В.И. Соколов, Е.И. Чумасов. – Москва : КолосС, 2004. – 345 с.

  5. Сулейманов С.М. Комплексная морфометрическая оценка капсулы печени / С.М. Сулейманов, П.Г. Маркин, И.С. Толкачев // Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медици- ны. – Москва, 2007. – Ч. III. – С. 169-173.

  6. Ташке К. Введение в количественную цитогистохимиче- скую морфологию / К. Ташке. – Издательство академии Румынии, 1980. – 191 с.

  7. Хесин Я. Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток / Я. Е. Хесин. – Москва : Медицина, 1967. – 423 с.

  8. Yomori Y. Am. Endocrinology. – 1950. – V. 20. – 665 р.

Учебное издание Коллектив авторов


ОСНОВЫ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ


Учебное пособие

Редакторы О.В. Ситникова, С.А. Дубова Компьютерная верстка Л.А. Козьменко

Подписано в печать 26.01.2015. Формат 60×84 1/16.

Печать офсетная. Бумага кн.-журн. П.л. 8,0

Гарнитура Таймс. Тираж 220 экз. Заказ № 11494

ФГБОУ ВПО Воронежский ГАУ Типография ФГБОУ ВПО Воронежский ГАУ



394087 Воронеж, ул. Мичурина, 1.


Поделитесь с Вашими друзьями:
1   ...   22   23   24   25   26   27   28   29   30




База данных защищена авторским правом ©www.vossta.ru 2022
обратиться к администрации

    Главная страница