Проведение образцов через смолы

Четвертый день фиксации материала

Пятый день фиксации материала

1. 
   Вынуть пластинку из термостата и оставить при комнат- ной температуре под стеклянным колпаком в течение ч. При бо- лее продолжительном охлаждении пластинки блоки трудно под- даются выбиванию. Блоки можно выбивать сразу после взятия пластинки из термостата.
   

2. 
   Снять пленку и лейкопластырь с номерами.
   
3. 
   Пластинку положить на 2 подставки, между которыми оставляют пространство. При помощи выбивалки, диаметр кото- рой 4 мм, со стороны материала резким движением и ударом ру- кой по держателю выбивалки выбивают блоки.
   
4. 
   Одновременно проверяя номера на блоках, блоки склады- вают в бумажные пакеты. В каждом пакете складывают блоки из одного образца (т. е. 5 блоков). На пакетах пишут № образца.
   

3. Приготовление матрицы для бескапсульной заливки блоков

На боковую поверхность пластинки наклеить полосу лейко- пластыря, на которой выписывают номера образцов.

В образовавшиеся ячейки закладывают папиросную бумагу с напечатанными номерами образцов. Номера, написанные на лейко- пластыре и бумаге, должны соответствовать. Для каждого образца материала используется 5 ячеек. Вырезанные номера закладываются в ячейки хирургическим пинцетом, осторожно, чтобы не повредить им ленту, покрывающую дно пластинки. Номера закладываются на- печатанной стороной наружу, т.е. к стенке ячейки.

Пластинка приготавливается на второй день фиксации мате- риала. Таким образом приготовленная пластинка ставится в тер- мостат для подсушивания при температуре 37С на 18-24 ч. (до заливания блоков). При необходимости пластинку можно подсу- шить при 60С в термостате в течение 1 ч. (но нежелательно).

3. Изготовление мерных бюксов для приготовления смолы

3. Окрашивание сеток с материалом

   1. 
      Приготовление реактивов
      

1. 
   4% уранилацетат - 400 мг уранилацетат + 10 мл биди- стиллированной воды и тщательно встряхивать в течение 30 мин. Приготовленный раствор можно хранить в холодильнике неогра- ниченное время. Уранилацетат трудно растворяется в воде и дает небольшой осадок. Перед употреблением нужное количество следует профильтровать через бумажный фильтр. Неиспользо- ванный фильтрат вылить обратно во флакон для хранения.
   
2. 
   1н NaOH: 4 г едкого натра довести до 100 мл бидистил- лированной водой
   

3. 
   Цитрат свинца (материнский раствор). Для приготовления свинца свинец азотнокислый Pb(NO3)2 в количестве 1,33 г и на- трий лимоннокислый Na(C6H3O7)H2O в количестве 1,76 г (если трехзамещенный с содержанием воды 5,5 мл – 2,8 г) смешивают и тщательно встряхивают в течение 30 мин. с 30 мл бидистиллиро- ванной воды в колбочке. Данная смесь окрашивается в молочно- белый цвет, непрозрачная, густой консистенции. После взбалтыва- ния в течение 30 мин., туда добавляется 8 мл 1н NaOH, раствор сразу должен стать прозрачным. Далее доливают до 50 мл отметки бидистиллированную воду. Приготовленный цитрат свинца (рН=12) хранится в холодильнике 6 месяцев. Если во время хране-
   

ния выпадает осадок, то данный раствор применять нельзя и надо приготовить новый. Выпадение свинца связано с неаккуратным приготовлением и применением грязной посуды. Поэтому посуда должна быть чистой (хромпик 2-3 дня, проточная, дистиллирован- ная, бидистиллированная вода, высушить в сушильном шкафу при температуре 120С. Перед обработкой в хромпике посуду промыть в мыльном порошке и прополоскать в воде).

4. 
   Цитрат свинца для окрашивания материала: 1 мл мате- ринского цитрата свинца + 5 мл 0,01 н NaOH. Готовить в вытяж- ном шкафу, посуда должна быть чистой. Цитрат свинца для ок- рашивания материала готовить за 10 мин. до окрашивания.
   

1. Окрашивание сеток

1. 
   Два парафиновых бюкса почистить шпателем. При помо- щи шпателя легким движением снять верхний слой парафина внутри луночки. В результате этого внутренний слой луночки на- чинает блестеть. После чистки луночек бюкса шпателем, в боко- вые углубления бюкса наливают бидистиллированную воду до образования выпуклой поверхности. Чашку с парафиновым бюк- сом нужно поворачивать, чтобы треугольная выемка, вырезанная в парафиновом бюксе, находилась вверху. При помощи пинцета из бюкса №… берется сетка и кладется в луночки. Закладку сеток начинают с верхней левой стороны парафинового бюкса. Срезы образцов нанесены на 5 сеток. Для окрашивания обычно из них используют 2 сетки под номером 1 и 5 (при резке блоков лучшие срезы наносятся на сетки, которые кладутся в углубления бюкса под номером 1 и 5). Одновременно на листочки, находящиеся в крышечке бюкса, на которой написаны номера образцов и номера сеток, подчеркиваются номера окрашенных сеток.
   

Приготавливают 1н NaOH, 0,01н NaOH, 0,02 NaOH. За 10-15 мин. до окончания окраски уранилацетатом готовят цитрат свинца для окрашивания сеток, т.е. материала. Берут 1 мл цитрата свинца материнского + 5 мл 0,01н NaOH. Далее берут вторую чашку с па- рафином для окрашивания материала (луночки должны быть зара- нее почищены), и в боковые отверстия бюкса вносится таблетка ед- кого натра. В луночки бюкса чистой глазной пипеткой наливают приготовленный цитрат свинца. Луночки наполняют цитратом свинца до выпуклой формы. Заполнение луночек начинается в верх- нем левом углу. Крышка чашечки должна быть только приоткрыта, стараться не дышать. Крышку приоткрывать от себя, т. е. заполнять луночки, находящиеся далее от себя.

Чашку с парафиновым бюксом поворачивают, чтобы треуголь- ная выемка, вырезанная в парафиновом бюксе, находилась вверху.

Приготовить 3 стаканчика со свежеприготовленной бидистил- лированной водой.

Через 1,5 ч. с момента нанесения сеток с материалом в ура- нилацетате парафиновый бюкс с окрашенными сетками вынима- ют из термостата. Далее, начиная с верхнего левого угла, при по- мощи пинцета вынимают одну сеточку и промывают ее в трех стаканчиках с бидистиллированной водой по 30 раз в каждом стаканчике. Промывание проводить быстрыми движениями.

После промывания во всех трех стаканчиках сеточку легко встряхивают и помещают в парафиновую чашку № 2 с цитратом свинца. Крышку чашечки приоткрывают от себя.

После перемещения всех сеток, крышку чашки круговым движением слегка притирают к парафиновому бюксу. Свободное пространство между крышкой и чашкой заполняют бидистилли- рованной водой. Потом закрытую чашку покрывают чашечкой черного цвета и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч.

Через 0,5 ч. после нанесения сеток с материалом в цитрате свинца вынимают по одной сетке, начиная с верхнего левого угла, и промывают ее в 0,02н NaOH – 60 раз; в бидистиллированной воде – 60 раз; в бидистиллированной воде – 60 раз. Промывать быстро, резким движением перемещая сетку по направлению вверх, вниз в жидкости, считая, сколько раз погружается сетка в жидкость.

После промывания сетку бросают на фильтровальную бума- гу, после чего ее помещают в бюксе ячейки, откуда сетка выни-

малась для окрашивания. Парафиновые чашки № 1 и № 2 промы- вают под струей воды и переворачивают вверх дном на фильтро- вальную бумагу для высушивания. Всю посуду после примене- ния цитрата свинца промывают в 1н NaOH, затем как обычно.

3. Окрашивание сеток с материалом

1. 
   Парафиновые бюксы почистить шпателем (снять тонкий слой).
   
2. 
   В парафиновый бюкс № 1 (для уранилацетата) накапать бидистиллированную воду в боковые углубления.
   
3. 
   Профильтровать 4% уранилацетат (небольшое количест- во) и накапать глазной пипеткой в луночки.
   
4. 
   Чашку с парафиновым бюксом поворачивают, чтобы треугольная выемка, вырезанная в парафине, находилась вверху
   
5. 
   В луночки положить сеточки в определенном порядке
   

6. 
   Отмечать на листочке находящиеся в крышечке бюкса срезы, номера ячеек, из которых брались срезы для окраски.
   
7. 
   Крышку круговым движением слегка притереть к пара- финовому бюксу.
   
8. 
   Свободное пространство между крышкой и чашкой за- полняют бидистиллированной водой.
   
9. 
   Чашку с сетками поместить в термостат при температуре
   

10. 
    Приготовить сразу после помещения чашки в термостат
    

11. 
    За 10-15 мин. до окончания окраски уранилацетатом готовят цитрат свинца для окрашивания материала (1 мл мате- ринского цитрата свинца + 5 мл 0,01 н NaOH).
    
12. 
    В углубления пристеночного бюкса № 2 внести таблет- ки едкого натра.
    
13. 
    В луночках бюкса № 2 наливают приготовленный цит- рат свинца для окрашивания материала. Во время нанесения ста- раться не дышать.
    
14. 
    Приготовить 3 стаканчика со свежеприготовленной би- дистиллированной водой.
    

15. 
    Вынуть бюкс № 1 из термостата (через 1,5 ч. после на- несения в него материала).
    
16. 
    Вынимать по одной сетке из бюкса № 1. Каждую сетку погружать в стаканчики с бидистиллированной водой – по 60 раз.
    
17. 
    После промывания сетки во всех трех стаканчиках се- точку легко встряхивают или просушивают, прикладывая к фильтровальной бумаге, и помещают в парафиновую чашку (бюкс) с цитратом свинца.
    
18. 
    После перемещения всех сеток бюкс закрывают крыш- кой, которую слегка притирают к парафиновому бюксу.
    
19. 
    Пространство между крышкой и чашкой заполняют би- дистиллированной водой.
    
20. 
    Закрытую чашку накрывают чашкой из черного цвета и оставляют при комнатной температуре на 0,5 ч.
    
21. 
    Приготовить 3 стаканчика для промывания сеток: в стаканчик №1 налить 0,02н NaOH, в стаканчик № 2 – бидистил- лированную воду, в стаканчик №3 – бидистиллированную воду.
    
22. 
    Через 30 мин. после нанесения сеток в цитрате свинца, вынимают по одной сетке из бюкса № 2. После сетку быстрым движением помещают в стаканчик № 1. Стараться в это время не дышать. В каждом стаканчике промывать по 60 раз.
    
23. 
    После промывания сетку бросают на фильтровальную бумагу и сразу после этого помещают в бюкс ячейки, откуда сет- ка вынималась для окрашивания (т.е. бокс для хранения сеток). Парафиновые чашки № 1 и № 2 промывают под струей воды и переворачивают вверх дном для высушивания. Всю посуду после применения цитрата свинца промывают в 1н NaOH.
    

Вопросы для самоконтроля

1. 
   Как производится отбор проб для электронной микро- скопии?
   
2. 
   С помощью каких реактивов фиксируют материал?
   
3. 
   Опишите окрашивание сеток с материалом.
   
4. 
   Назовите преимущества электронной микроскопии перед световой.
   

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. 
   Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Ав- тандилов. – Москва : Медицина, 1990. – 384 с.
   
2. 
   Авцын А. П. Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии / А. П. Авцын, А. И. Струков, Б. Б. Фукс. – Ленинград : Медицина, 1971. – 368 с.
   
3. 
   Артишевский А.А. Гистология с техникой гистологических исследований : учебное пособие / А.А. Артишевский, А.С. Леонтюк, Б.А. Слука. – Минск : Высшая школа, 1999. – 226 с.
   
4. 
   Гайер Г. Электронная микроскопия / Г. Гайер. – Москва :
   

5. 
   Гольдин Л. С. Основы гистологической техники элек- тронной микроскопии / Л. С. Гольдин. – Москва : Государствен- ное издательство медицинской литературы, 1963. – 257 с.
   
6. 
   Елисеев В. Г. Основы общей гистологии и гистологиче- ская техника / В. Г. Елисеев. – Москва : Медгиз, 1999. – 214 с.
   
7. 
   Жаров А.В. Патологическая анатомия животных : учеб- ник / А.В. Жаров. – Москва : Лань, 2013. – 608 с.
   
8. 
   Жаров А.В. Судебная ветеринарная медицина : учебник /
   

9. 
   Кононский А. И. Гистохимия / А. И. Кононский. – Мо- сква : Наука, 1976. – 280 с.
   
10. 
    Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли. – Москва : Мир, 1969. – 639 с.
    
11. 
    Лойда З. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы
    

12. 
    Меркулов Г. А. Курс патологогистологической техники
    

13. 
    Микроскопическая техника : руководство / под редак- цией Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова – Москва : Медицина, 1996.
    

14. 
    Методы морфологических исследований : методическое пособие / С.М. Сулейманов [и др.]. – Воронеж : ВГАУ, 2012. – 103 с.
    
15. 
    Патоморфологическая диагностика болезней животных :
    

• 
  Москва : Аквариум, 2013 . – 231 с.
  

16. 
    Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс.
    

• 
  Москва : Издательство иностранной литературы, 1962. – 962 с.
  

17. 
    Поликар А. Субмикроскопические структуры клеток и тка- ней в норме и патологии / А. Поликар, Ш. А. Бо. – Ленинград : Лен- медгиз, 1962. – 468 с.
    
18. 
    Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. – Моск- ва : Издательство иностранной литературы, 1954. – 719 с.
    
19. 
    Салимов В. А. Практикум по патологической анатомии животных / В. А. Салимов. – Москва : Лань, 2013. – 352 с.
    
20. 
    Соколов В.И. Цитология, гистология, эмбриология : учеб- ник /В.И. Соколов, Е.И. Чумасов. – Москва : КолосС, 2004. – 345 с.
    
21. 
    Сулейманов С.М. Комплексная морфометрическая оценка капсулы печени / С.М. Сулейманов, П.Г. Маркин, И.С. Толкачев // Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медици- ны. – Москва, 2007. – Ч. III. – С. 169-173.
    
22. 
    Ташке К. Введение в количественную цитогистохимиче- скую морфологию / К. Ташке. – Издательство академии Румынии, 1980. – 191 с.
    
23. 
    Хесин Я. Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток / Я. Е. Хесин. – Москва : Медицина, 1967. – 423 с.
    
24. 
    Yomori Y. Am. Endocrinology. – 1950. – V. 20. – 665 р.
    

Учебное издание Коллектив авторов

ОСНОВЫ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Редакторы О.В. Ситникова, С.А. Дубова Компьютерная верстка Л.А. Козьменко

Подписано в печать 26.01.2015. Формат 60×84 1/16.

Печать офсетная. Бумага кн.-журн. П.л. 8,0

Гарнитура Таймс. Тираж 220 экз. Заказ № 11494

ФГБОУ ВПО Воронежский ГАУ Типография ФГБОУ ВПО Воронежский ГАУ